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β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase,EC 3.2.1.21)能够特异性的水解结合于末端非还原性的β-(1,4)糖苷键,释放出配基与葡萄糖,而配基大多为生物活性中间体,广泛应用于医药、食品、甜味剂等行业,因此β-葡萄糖苷酶的活性和功能逐渐成为研究的热点。微生物来源的β-葡萄糖苷酶,尤其是丝状真菌来源的酶具有较高的酶活力,工业应用前景广阔,但丝状真菌酶系比较复杂,β-葡萄糖苷酶含量和比例较低。本研究旨在从不同丝状真菌微生物中筛选β-葡萄糖苷酶基因,并对编码基因进行克隆及外源表达,研究其性质功能以及对不同底物的水解特性。从NCBl查询β-葡萄糖苷酶的信息,对这些基因进行系统进化树分析,经过分析比对及相关资料查询,选取了亲缘关系相差较大的β-葡萄糖苷酶基因作为研究对象,从而获得不同性能的β-葡萄糖苷酶。将黑曲霉TCCC 41064、米曲霉TCCC 41672、斜卧青霉TCCC 41604、里氏木霉TCCC 41022作为研究对象,分别设计引物PCR扩增到全长的目的基因bglA、bglA(o)-1和bg/A(o)-2、bglP、bg/T,并全基因优化合成棘孢曲霉和粗糙脉孢菌来源的目的基因bglA(a)和bglN。这七种目的基因分别与表达载体pPlC9K连接构建重组质粒,在毕赤酵母中实现重组表达。经摇瓶发酵,BglA粗酶液酶活力最高,为90.85±3.5 U/mL。但BglA(o)-l、BglA(o)-2和BglT未检测到酶活力。经纯化后,BglA比活力最高,为324.4 U/mg。酶学性质研究表明,四种有活力的重组酶Bgl的最适温度范围在55-70℃;最适pH范围在5.0-6.5;BglA、BglA(a)温度稳定性较好,在50℃条件下保温10h后,酶活力仍能残余80%;BglA、BglA(a)在pH 5.0-7.0较为稳定,BglP、BglN在pH 3.0-8.0较为稳定。Ca2+、Mg2+对四种重组酶活力都有明显的的激活作用。由于同来源的重组酶对同一底物转化率差别明显,同种酶对不同底物转化率也有差别,为进一步从结构上来研究分以析,从PDB 网站上查找到β-葡萄糖苷酶的蛋白模型4IIB和3ZYZ。BglA、BglP和BglA(a)与模型4IIB结构相似的度分别为90%,82%和100%。BglN与模型3ZYZ结构相似的度为75%。模型4IIB对底物的水解能力依次是熊果苷、水杨苷、京尼平苷、虎杖苷、纤维二糖。模型3ZYZ对底物的水解能力依次是京尼平苷、熊果苷、虎杖苷、水杨苷、纤维二糖。重组酶BglA、BglP和模型4IIB对底物对接模拟数据有一定差别。底物对接模拟数据也为后序定点突变提高β-葡萄糖苷酶性能提供了数据参考。底物特异性研究表明,BglA(a)对水杨苷、纤维二糖以及熊果苷的转化率最高,分别为26.07%、15.35%、42.85%;BglN对京尼平苷的转化率最高,为47.12%;BglA对虎杖苷的转化率最高,为17.7%。经过研究对比,BglA 的性能较好。BglA经过7 L发酵罐放大实验,酶活力提高到289 U/mL,是摇瓶发酵的3.2倍。