研究背景食管癌（Esophageal cancer,EC）是世界上发病率排名第七、死亡率排名第六的常见恶性肿瘤。尽管近年食管癌治疗手段有了长足进展,尤其是包括手术、化疗、放疗在内的综合治疗的应用,但食管癌病人的预后情况仍不令人满意。手术是主要根治手段,但术后复发率约50%,且大部分病人在确诊时已是中晚期。因此,探索食管癌生长转移的机制对于发现食管癌新型治疗靶点、研发新型药物意义重大。N6-甲基腺苷（m6A）是真核细胞中信使RNA（mRNA）上最常见的内在修饰方式。m6A甲基化过程涉及甲基化酶（“Writers”）和去甲基化酶（“Erasers”）,甲基化酶包括甲基转移酶 3（Methyltransferase-like 3,METTL3）、METTL14 和 Wilms tumor 1 相关蛋白（Wilms tumor 1-associated protein,WTAP）等;去甲基化酶包括脂肪和肥胖相关蛋白（Fat-mass and obesity-associated protein,FTO）以及 ALKB同源物5（ALKB homolog 5,ALKBH5）。研究表明,m6A甲基化对于多种生物过程具有显著调控作用,如RNA稳定性、降解和翻译,昼夜节律调控以及能量稳态等。最新研究发现m6A及其调控蛋白（包括ALKBH5）对于肿瘤发生发展具有重要影响。有文献报道,METTL3可通过AKT通路促进食管癌细胞的增殖和侵袭,与食管癌病人预后显著相关。然而,包括ALKBH5在内的其他m6A调控蛋白在食管癌中的功能有待研究。小RNA（microRNA,miRNA）可调控细胞内约60%的编码基因,其通过与mRNA结合来抑制mRNA翻译或促进mRNA降解,在肿瘤的发生发展过程中发挥重要调控功能。miRNA的生成离不开“微处理复合体”,其由DiGeorge综合征关键区域基因 8（DiGeorge syndrome critical region gene 8,DGCR8）和 Drosha 核糖核酸酶Ⅲ（Drosharibonuclease Ⅲ,DROSHA）构成;该复合体可将miRNA初级转录本（Primary miRNA,pri-miRNA）剪切成为 miRNA 前体（Precursor miRNA,pre-miRNA）。已有研究提示,m6A甲基化酶可上调pri-miRNA的m6A甲基化水平并促进其与DGCR8结合。但在食管癌中,m6A去甲基化酶对此过程的调控作用以及相关pri-miRNA的剪切情况尚未明确。本研究旨在:（1）探索ALKBH5在食管癌中发挥何种作用、ALKBH5与食管癌病人预后的相关性;（2）验证ALKBH5对于下游miRNA的调控作用及其机制;（3）明确ALKBH5/miRNA下游通路。材料方法1.细胞系构建:（1）稳转细胞系,使用ALKBH5过表达和敲低慢病毒转染Kyse150和ECa109细胞系,使用嘌呤霉素进行筛选,得到ALKBH5过表达和敲低稳转细胞系及其对照细胞系;（2）瞬转细胞系,用野生型/H204A突变型ALKBH5过表达质粒、RAI1过表达质粒和siRNA、野生型/突变型194-2HG过表达质粒、miR-194-2和miR-192的mimic/inhibitor分别转染细胞,构建瞬转细胞系及其对照细胞系。2.细胞增殖检测:（1）细胞计数和CCK-8检测,将3×103/孔或5×103/孔数量的细胞种于孔板,每24h进行一次人工计数和CCK-8检测,获取各组细胞数目和OD值;（2）EdU检测,1×105/孔的细胞种于孔板,24h以后采用EdU试剂盒对细胞进行染色、荧光显微镜拍照。（3）克隆形成检测,1×103/孔的细胞种于六孔板,12天后进行结晶紫染色并拍照、计数（只计数含50个细胞以上的克隆）。3.细胞迁移检测:（1）Transwell检测,使用无血清培养基将6/8/10×104细胞接种于上室,下室加入含20%FBS的培养基作为趋化剂。24 h后进行固定、结晶紫染色并显微镜下计数。（2）划痕愈合实验,细胞种于六孔板,用200 μL枪头进行划痕,24 h或30 h后进行拍照,观察划痕愈合情况。4.m6A 和 DGCR8 免疫共沉淀:采用 Magna RIPTM RNA-Binding Protein Immunoprecipitation Kit进行本部分实验。将细胞进行裂解,裂解物与抗m6A、抗DGCR8一抗或IgG抗体包被的磁珠进行孵育。抗体-RNA结合物用蛋白酶K进行分离,所得产物进行实时定量PCR检测。5.逆向RNA免疫共沉淀（pull-down实验）:合成生物素标记的194-2HG捕获探针及对照探针。细胞裂解物与生物素标记的探针进行孵育,采用Pierce Magnetic RNA-Protein Pull-Down Kit试剂盒进行pull-down实验,所得蛋白产物采用Western Blot进行分析。6.染色质免疫共沉淀:采用 Epigentek Chromatin immunoprecipitation Kit 进行本部分实验。抗体为抗RAI1一抗、IgG抗体。将1:20稀释的input和ChIP产物进行PCR扩增,用1.5%琼脂糖凝胶进行核酸凝胶电泳实验。7.免疫荧光:细胞经甲醇固定15分钟,再用含0.1%Triton X-100的PBS洗涤,5%山羊血清室温封闭1小时。然后与一抗（抗RAI1、YAP、TAZ一抗）4℃孵育过夜,次日与Alexa Fluor 488或Dylight 594荧光二抗进行交联。细胞核采用DAPI染色。8.双荧光素酶报告实验:构建含有野生型和突变型RAI1-3’UTR序列的荧光素酶质粒。用荧光素酶质粒和miR-194-2mimic对细胞进行共转染。48h后,采用Luc-PairTM Duo-Luciferase Assay Kit 2.0 检测荧光素酶活性。9.体外维替泊芬敏感性实验:用不同浓度的维替泊芬处理细胞,72h后采用CCK-8试剂盒检测各组OD值,计算细胞存活率或抑制率（维替泊芬组vs对照组）。细胞经5 μM维替泊芬处理后,进行Transwell迁移检测,并计算迁移率或抑制率。10.皮下成瘤实验:用4周龄雌性BALB/c裸鼠进行本部分实验。将5 ×106细胞进行皮下注射（n=6）,后进行随机分组。肿瘤肉眼可见后,每三天进行一次肿瘤体积测量。体积计算公式为:X2×Y×0.5,X为肿瘤短径,Y为肿瘤长径。26或28天后,处死裸鼠进行后续实验。11.体内维替泊芬敏感性实验:皮下肿瘤模型构建如上。皮下肿瘤肉眼可见后,根据肿瘤体积对裸鼠进行匹配分组,使用维替泊芬（100 mg/kg）或溶剂进行腹腔灌注（n=5）,每两天灌注一次、持续两周。监测肿瘤体积变化。12.临床标本及信息获取:（1）从齐鲁医院胸外科获取32例新鲜食管癌组织,冻存于-80℃,用于后续实验。（2）从齐鲁医院病理科获取105例食管癌石蜡切片组织并随访获取预后信息,用于后续实验和分析。13.免疫组织化学:人食管癌组织或皮下成瘤组织的石蜡切片进行脱蜡水化,5%山羊血清进行封闭,用抗ALKBH5、RAI1一抗4℃孵育过夜。次日进行二抗孵育及DAB染色,对各切片进行染色分级,分为低表达和高表达组。14.生物信息学分析:三级转录组数据、miRNA数据、临床数据均来自TCGA数据库。DNA突变数据来自cBioportal。mRNA富集分析采用DAVID进行。miRNA富集采用TAM进行。miRNA靶点预测采用miRDB进行。m6A位点预测采用SRAMP软件。15.统计分析:GraphPad Prism 7.0 和 Statistical Package for Social Science（SPSS）用以分析数据。Kaplan-Meier生存分析采用log-rank检验。其他统计分析采用t检验、one-way ANOVA、Pearson检验或卡方检验。数据以均值±标准差（SD）或标准误（SEM）展示。P＜0.05具有统计学意义。结果1.ALKBH5与食管癌病人预后正相关:TCGA数据库分析发现各m6A调控蛋白中ALKBH5与食管癌病人预后相关性最强,泛癌分析显示各肿瘤中食管癌和ALKBH5相关性最强。TCGA数据库和我们的食管癌队列均表明,ALKBH5高表达者预后优于低表达者。ALKBH5高表达与更少的淋巴结转移、更好的TNM分期及术后更少的复发转移相关。2.ALKBH5抑制食管癌细胞增殖和迁移:过表达ALKBH5后,细胞的增殖能力和迁移能力均受明显抑制;而敲低ALKBH5后,相关恶性表型均明显增强。裸鼠皮下成瘤进一步验证了 ALKBH5的抑癌作用。3.ALKBH5抑制miR-532簇和miR-194-2簇的生成:生信分析显示miR-532簇和miR-194-2簇和ALKBH5相关性最强。ALKBH5过表达可显著降低miR-194-2、miR-192 以及 miR-502、miR-532、miR-188 水平;而敲低 ALKBH5 后,五个miRNAs水平显著升高。但ALKBH5并未影响pri-miR-194-2和pri-miR-532含量。皮下成瘤模型和人食管癌组织进一步验证了 ALKBH5和上述miRNAs的相关性。4.ALKBH5通过m6A发挥调控miRNAs生成、抑制肿瘤的作用:野生型ALKBH5质粒可挽救ALKBH5敲低导致的食管癌细胞增殖迁移能力及上述miRNAs含量的变化,而ALKBH5突变体质粒（ALKBH5-H204A）的挽救作用则明显减弱。野生型ALKBH5可降低上述pri-miRNAs的m6A水平,而ALKBH5-H204A相应功能则显著减弱。ALKBH5可抑制上述pri-miRNAs与DGCR8的结合。选取pri-miR-194-2中3个m6A位点进行突变并构建突变体质粒（194-2HG-MT）。相比于野生型194-2HG组,194-2HG-MT促进细胞增殖迁移的作用明显减弱;且该现象在ALKBH5敲低细胞中更为显著。5.miR-194-2介导ALKBH5的抑癌作用:miR-194-2 mimic能显著促进细胞增殖和迁移,而miR-194-2 inhibitor可抑制细胞增殖和迁移。miR-192对上述表型无明显影响。miR-194-2 mimic/inhibitor能够逆转ALKBH5变化导致的细胞增殖迁移能力的改变。6.RAI1为ALKBH5/miR-194-2的下游靶点:生信分析显示RAI1和ALKBH5/miR-194-2的相关性最强。ALKBH5过表达和miR-194-2 inhibitor可提高RAI1蛋白表达,而ALKBH5敲低和miR-194-2 mimic则降低RAI1蛋白表达。miR-194-2 mimic/inhibitor可逆转ALKBH5变化导致的RAI1表达的改变。皮下成瘤模型和人食管癌组织进一步验证了 ALKBH5和RAI1的关系。7.RAI1在食管癌中发挥抑癌作用:TCGA数据库和我们的食管癌队列均显示,RAI1和食管癌病人总生存正相关。过表达RAI1可抑制食管癌细胞的增殖迁移,而敲低RAI1则促进食管癌细胞的增殖迁移。RAI1可明显减弱ALKBH5敲低或miRNA194-2 mimic引起的细胞增殖、迁移能力的增强。8.Hippo-YAP通路为RAI1下游通路:生信分析提示,RAI1表达和Hippo通路相关性最强,且与Hippo通路上游基因NF2、FRMD6、LLGL1的表达正相关。过表达RAI1后,细胞中NF2、FRMD6、LLGL1表达升高,YAP、TAZ磷酸化增强。过表达ALKBH5可激活Hippo通路、抑制YAP/TAZ入核,而敲低RAI1可逆转该趋势。9.低表达ALKBH5的食管癌细胞对维替泊芬更敏感:维替泊芬对ALKBH5敲低细胞及其对照细胞的增殖迁移均有抑制作用,且对ALKBH5敲低细胞的抑制作用更明显。体内实验表明,维替泊芬对ALKBH5敲低组肿瘤生长的抑制作用显著强于对照组。结论1.ALKBH5在食管癌中发挥抑癌作用,与食管癌病人预后正相关;2.ALKBH5通过其m6A去甲基化功能抑制pri-miRNA与DGCR8的结合,从而降低miR-194-2生成、发挥抑癌作用;3.RAI1 是 ALKBH5/miRNA194-2 的下游靶点,且 ALKBH5/miRNA194-2 通过RAI1调控Hippo-YAP通路,进而影响食管癌恶性表型;4.ALKBH5低表达的食管癌对维替泊芬治疗更敏感。