Luman recruiting factor(LRF)又叫做CREB3 regulate factor(CREBRF),它是一个内质网应激相关的亮氨酸拉链蛋白转录因子。LRF是CREB家族成员Luman的负反馈调节因子,它一方面通过募集Luman进入核小体而抑制Luman的活化,另一方面与Luman结合而加速Luman蛋白的降解。在小鼠分娩与产后期,LRF通过抑制糖皮质激素压力信号进而抑制HPA轴的活性。LRF基因敲除鼠中糖皮质激素受体表达异常升高,PRL的表达下降,导致产后母鼠母性行为缺失。LRF在发情周期和早期胚胎植入过程中的小鼠子宫中呈规律性表达,在妊娠小鼠第6-7 d子宫的初级蜕膜区及次级蜕膜区的表达量很高。提示LRF在小鼠子宫中的表达可能受甾类激素的调节,而且,LRF可能在胚胎植入或蜕膜化过程中有一定的作用。本试验应用qRT-PCR、western blot、免疫组化、慢病毒干扰等技术检测了(1)甾类激素对LRF在小鼠子宫中表达的调控作用;(2)LRF干扰后对小鼠胚胎植入以及蜕膜化的影响;此外,研究了LRF干扰后对基质细胞体外诱导蜕膜化的影响。1.扩增了LRF基因的CDS区的全长序列,选取三个LRF的干扰靶点,并用T4连接酶将上述碱基序列重组入慢病毒载体。转化入E.coli DH5α感受态细菌后,挑取单克隆进行PCR鉴定与测序鉴定。将鉴定正确的重组质粒与包装质粒用转染试剂TuboFect共转入HEK 293T细胞进行病毒包装。将得到的慢病毒感染HEK 293T细胞进行慢病毒滴度测定。运用qRT-PCR和Western blot技术检测LRF过表达和干扰慢病毒在NIH 3T3细胞中的过表达与干扰效果。包装的LRF过表达慢病毒能显著升高外源的LRF蛋白的表达。包装的shLRF干扰慢病毒中pCD513B-U6-shLRF-2205片段可以显著干扰LRF蛋白的表达。LRF干扰与过表达慢病毒的运用,对进一步研究LRF在小鼠中的生理学功能具有重要意义。2.运用western blot、免疫组化等技术检测了在甾类激素E2和P4的作用下,LRF蛋白在卵巢摘除小鼠子宫和基质细胞中的表达。结果显示,P4能显著上调LRF蛋白在卵巢摘除的小鼠子宫和原代基质细胞中的表达,并且以时间依赖的方式上升。而且,孕酮受体拮抗剂米非司酮(RU486)能显著的下调LRF的表达。尽管E2处理卵巢摘除小鼠与原代基质细胞后LRF蛋白的表达没有明显的变化,但是,与孕酮处理组相比,E2与P4联合处理组中LRF蛋白的表达显著下调。而且,与E2组、对照组相比,在雌激素受体拮抗剂氟维司(ICI 182780)群处理组,LRF蛋白的表达显著上调。这些结果表明,LRF在小鼠子宫与基质细胞中的表达经由P4-PGR通路调节,而且雌激素能够部分地抑制P4上调的LRF表达。3.运用shLRF干扰慢病毒感染怀孕第3天的小鼠子宫,可以显著减少妊娠第7-8 d胚胎植入位点的大小与重量。在体外诱导蜕膜化的基质细胞模型中,LRF蛋白和mRNA表达随着人工诱导蜕膜化进程而显著升高。shLRF干扰慢病毒感染基质细胞并诱导蜕膜化,蜕膜化标记因子dPRP、IGFBP-1和PGR的表达下调,蜕膜化进程也受到抑制。运用流式细胞术检测体外蜕膜化基质细胞的细胞周期与细胞凋亡发现,shLRF干扰慢病毒感染基质细胞后对细胞凋亡没有明显的影响。但是,蜕膜化基质细胞的细胞周期在LRF干扰以后被阻滞在了S期。qRT-PCR检测与S期细胞周期相关的或者与蜕膜化相关的细胞周期调节因子发现,shLRF慢病毒干扰蜕膜细胞后,cyclin A与cyclin B1的mRNA表达显著降低,而cyclin D3与cyclin E的mRNA表达没有变化。因此,本试验说明了LRF参与小鼠子宫基质蜕膜化的调节,并通过调节细胞周期因子cyclin A与cyclin B1进而调节蜕膜化进程。本研究证实了内质网应激的相关蛋白-LRF在小鼠子宫中的表达受甾类激素的调控;而且,LRF通过调节细胞周期相关基因cyclin A和cyclin B1的表达参与基质细胞蜕膜化的调节。揭示了LRF参与雌性小鼠生殖系统的生理调节,并为进一步研究LRF在哺乳动物生殖过程中的作用提供了一个起点,也为对内质网应激与哺乳动物生殖之间的关系理解添加了一个新的方向。