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研究背景肝纤维化(liver fibrosis)是由多种肝脏损伤因素引起慢性炎症反应后肝组织的瘢痕修复反应。慢性肝病,如肝硬化、肝癌和病毒介导的病原体感染,影响全世界数十亿人的健康。这些疾病通常以纤维化引发,主要表现为肝星状细胞(HSC)增殖,并活化为肌成纤维细胞,导致细胞外基质(extracellular matrix,ECM)过度沉积。活化的肌成纤维细胞和肝星状细胞是造成纤维化瘢痕形成的主要细胞,在肝纤维化进程中,肝星状细胞与其他肝脏驻留或募集的多种免疫细胞间相互作用,合成和释放多种细胞因子、趋化因子等信号分子,调控着肝纤维化进程。由于抗纤维化治疗的多种副作用和诊断无症状患者的困难,有效的药物仍然是一个急需解决的问题。目前关于免疫细胞的表型研究愈加细致,其对肝纤维化的不同时期的影响的相关研究也在争论中不断深入。TLR2是toll样受体(Toll-like receptor,TLR)家族成员,通过识别病原体相关分子模式和某些内源性配体,启动信号转导,导致炎症介质释放。TLR2的配体包括脂蛋白、脂肽、脂酸(LTA)、阿拉伯糖(LAM)。TLR2在不同的炎症疾病模型中的作用不同,TLR2的免疫调节作用是免疫学研究领域的热点之一。然而,目前TLR2在肝纤维化中的作用以及不同细胞亚群中TLR2对肝纤维化进程的影响尚不明确。因此,本研究以硫代乙酰胺(TAA)诱导的肝纤维化小鼠模型,研究TLR2缺失对肝纤维化的作用及对肝实质细胞、肝星状细胞、免疫细胞的影响,以期为肝纤维化的预防与治疗提供新的靶点。研究目的1.观察TLR2对肝纤维化进程的影响;2.探究TLR2对肝星状细胞、肝实质细胞、免疫细胞的数量和功能的影响;研究方法1.利用TAA腹腔注射,每3天1次,共12次,建立WT小鼠和TLR2-/-小鼠的肝纤维化模型;2.处死小鼠,解剖取出肝脏和脾脏,拍照,称重,计算脏器与体重比值,并分离出小鼠单个核细胞后计数;3.应用天狼星红染色观察TLR2缺失对胶原沉积的影响;4.应用Western Blot和免疫组织化学检测分析TLR2缺失对小鼠肝星状细胞活化标志α-SMA的蛋白表达水平的影响;5.实时荧光定量PCR检测肝纤维化对肝组织的TLR2的mRNA 水平的影响;6.利用H&E染色观察肝纤维化模型小鼠的肝脏炎症和瘢痕形成;7.利用实时荧光定量PCR检测TLR2缺失对肝组织的炎症因子和肝纤维化相关分子mRNA水平的影响;8.通过肝脏原位灌流-酶消化法分离出小鼠肝脏总细胞,分离液梯度密度叠加离心法分离出肝星状细胞,观察并培养、鉴定;9.实时荧光定量PCR检测TLR2缺失对肝星状细胞和肝实质细胞的炎症因子和肝纤维化相关分子mRNA水平的影响;10.通过流式细胞术检测TLR2缺失对肝纤维化进程中的肝脏和脾脏单个核细胞总数及巨噬细胞、NK细胞、NKT细胞、T细胞的比例和功能的影响;研究结果1.TLR2在纤维化的肝脏组织中表达降低天狼星红染色结果显示,与未处理的WT小鼠相比,TAA处理组小鼠肝脏组织Sirus Red染色的阳性面积显著增加,血管周围有大量胶原沉积;Western Blot实验进一步观察到,表征纤维化程度的蛋白α-SMA的表达显著增加;接下来,qPCR检测显示,相比于未处理的WT小鼠,TAA处理的WT小鼠肝脏组织中TLR2表达水平降低。表明肝纤维化模型构建成功,TLR2与肝纤维化发展有关。2.TLR2缺失加重小鼠的肝纤维化未处理的WT小鼠和TLR2-/-小鼠肝脏表面光滑,无颗粒感,质地柔软富有弹性,两组间无显著差异。但是,TAA诱导后,与WT小鼠相比,TLR2-/-小鼠的肝脏表面颗粒感更加明显。Sirus Red染色结果显示,与WT小鼠相比,TAA处理的TLR2-/-小鼠肝脏天狼星红染色阳性面积增加,在肝血窦附近可以看到明显的胶原沉积。免疫组化实验结果也显示,与WT小鼠相比,TAA处理的TLR2-/-小鼠α-SMA的表达明显升高。3.TLR2缺失加重小鼠的肝脏损伤H&E染色结果显示,与WT小鼠相比,TAA处理的TLR2-/-小鼠肝脏血管附近有大量炎症细胞浸润和纤维瘢痕的形成,呈现更加严重的肝损伤。4.TLR2缺失上调小鼠肝脏炎症和肝纤维化相关基因表达qPCR检测了肝脏炎症和纤维化相关基因,结果显示,与WT小鼠相比,TAA处理的TLR2-/-小鼠的纤维化相关基因TGF-β、collagen1、TIMP1显著上调,促纤维降解基因MMP2无明显变化,MMP9上调;炎症因子TNF-α水平上升,但IL-6无明显改变。5.TLR2缺失促进肝实质细胞和肝星状细胞的炎症和纤维化相关基因上调qPCR检测发现,与WT小鼠相比,TAA处理的TLR2-/-小鼠的肝星状细胞纤维化相关基因TGF-β无统计学差异,炎症因子IL-6水平明显上升,IL-1β、IL-18无明显变化;而肝实质细胞的纤维化相关基因TGF-β水平显著升高,炎症因子IL-6、IL-1β无明显变化。6 TLR2缺失对小鼠的肝脏和脾脏免疫细胞的影响6.1 TLR2缺失促进小鼠肝脏单个核细胞的浸润TAA处理后,与WT小鼠相比,TLR2-/-小鼠的体重无显著差异,但肝脏体重比和脾脏体重比略微降低,同时其肝脏中单个核细胞数量上升。6.2 TLR2缺失抑制小鼠肝脏巨噬细胞的应答能力WT小鼠中,TAA处理可以显著提高肝脏中M1型巨噬细胞和ly6Chi巨噬细胞比例。虽然TAA处理的TLR2-/-小鼠与未处理组相比,巨噬细胞比例及数量都显著升高,但是与TAA处理的WT小鼠组相比,TAA处理的TLR2-/-小鼠肝脏巨噬细胞比例及数量无显著变化;并且,TAA处理的TLR2--小鼠与未处理组相比,ly6Chi巨噬细胞、ly6Clo巨噬细胞比例均没有显著的变化,iNOS+的M1型巨噬细胞和CD206+的M2型巨噬细胞比例均没有显著的变化。而脾脏巨噬细胞数量及比例均无统计学差异,MHC-II和CD80水平的上调受到抑制。这些结果提示,TLR2缺失导致肝脏巨噬细胞的应答能力降低。6.3 TLR2缺失促进小鼠肝脏NK细胞的LAG3表达升高TAA处理后,WT小鼠和TLR2-/-小鼠肝脏NK细胞比例和总数、活化性分子CD69、杀伤性分子INF-γ、CD107a、perforin、抑制性分子TIGIT、LAG3均无统计学差异;但是,与未处理的TLR2-/-小鼠相比,TAA处理的TLR2-/-小鼠抑制性分子LAG3表达升高。脾脏NK细胞与肝脏NK细胞相似;但是,与未处理WT小鼠相比,TAA处理的WT小鼠脾脏NK细胞TIGIT和LAG3表达显著上调,TAA处理的TLR2-/-小鼠NK细胞TIGIT和LAG3表达无明显变化;与TAA处理的WT小鼠相比,TAA处理的TLR2-/-小鼠,活化性分子CD69上升。6.4 TLR2缺失对小鼠肝脏CD4+T细胞和CD8+T细胞比例的影响流式检测发现,与TAA处理的WT小鼠相比,TAA处理的TLR2-/-小鼠肝脏总的T细胞比例、数量均无明显变化;CD4+T细胞比例和数量显著增加,活化分子CD69、抑制性分子PD-1无明显影响;而CD8+T细胞比例和数量减少,活化分子CD69、抑制性分子PD-1无明显影响,但脱颗粒标志CD107a显著上升;CD4+T细胞与CD8+T细胞的比值显著升高。脾脏总T细胞比例增加,但数量无明显影响;CD4+T 比例、数量、活化分子CD69和抑制性分子LAG3、PD-1无明显变化;CD8+T比例略微升高,但数量无明显改变,活化分子CD69略有升高,杀伤相关的CD107a略微降低,抑制性分子LAG3、PD-1无明显影响;CD4+T细胞与CD8+T细胞比值无统计学差异。6.5 TLR2缺失不影响小鼠肝脏的NKT细胞流式检测分析发现,与TAA处理的WT小鼠相比,TAA处理的TLR2-/-小鼠,肝脏NKT细胞比例和总数、活化性分子CD69、杀伤性分子INF-γ、CD107a、perforin、抑制性分子LAG3均无明显影响;脾脏NKT细胞比例略微上升,但总的数量略微减少,活化性分子CD69、杀伤性分子INF-γ、CD107a、perforin、抑制性分子TIGIT、LAG3均无明显影响。结论及意义1.本研究发现,TLR2缺失可以促进肝纤维化,升高肝脏组织、肝实质细胞、肝星状细胞的炎症因子和纤维化相关分子的表达;2.TLR2缺失抑制小鼠肝脏巨噬细胞的应答能力,对NKT细胞没有显著影响;促进小鼠的肝脏NK细胞的LAG3表达升高,增加CD4+T细胞比例和数量,而减少CD8+T细胞比例和数量,使肝脏免疫微环境呈现为促纤维化的作用;3.本研究提示,TLR2表达抑制肝纤维化的进程,为开发新的治疗肝纤维化药物提供了新的靶点和实验依据。