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目的 中医认为肾开窍于耳,肾虚可导致耳鸣耳聋,临床研究发现肾病综合征、慢性肾炎、肾功能不全、糖尿病肾病等病症也容易引发听力障碍。滋补肝肾中药何首乌常被应用于治疗耳鸣耳聋的传统方剂中,如首乌丸、首乌延寿丹、七宝美髯丹、首乌熟地汤等。本研究采用网络药理学和实验验证相结合的方法,研究何首乌治疗耳鸣耳聋的有效成分和分子机制,以期为何首乌治疗耳损伤的临床应用提供依据,并为何首乌在临床耳损伤的应用奠定基础。方法 第一部分:通过HERB、ETCM数据库筛选何首乌的活性成分并预测活性成分的靶点;从DrugBank、OMIM、DisGeNET数据库收集耳鸣耳聋的疾病靶点;然后应用Venny 2.1.0软件筛选何首乌治疗耳鸣耳聋的疾病靶点;用Cytoscape 3.7.2软件构建药物-活性成分-疾病-靶点网络;利用STRING数据库构建PPI网络;使用Cytoscape 3.7.2的STRING插件对靶点进行GO富集分析和KEGG通路分析,并使用微生信平台呈现富集结果;利用Cytoscape 3.7.2软件构建药物-活性成分-靶点-通路网络;使用AutoDockTools 1.5.6软件进行分子对接,将最佳的化合物-靶点对放入PyMOL软件中进行可视化。第二部分:以对乙酰氨基酚（4-Acetamidophenol,APAP）诱导豚鼠耳损伤为研究模型,何首乌苷（2,3,5,4’-Tetrahydroxy stilbene-2-O-β-D-glucoside,TSG）处理后,测试豚鼠的听性脑干反应（Auditory brainstem response,ABR）、畸变产物耳声发射（Distortion product otoaeoustie emissions,DPOAE）等,判断听力损失情况,以听觉诱发惊跳反射（Acoustic startle reflex,ASR）、背景噪声间隙检测惊跳反射前抑制试验（gap-Prepulse inhibition,gap-PPI）对动物行为进行检测,判断听力损失情况,对耳蜗毛细胞进行免疫组化荧光实验来观察耳蜗毛细胞损伤情况,进一步验证TSG保护听力的作用,最后对豚鼠肝肾组织进行病理学观察,来判断TSG对肝肾的毒性。第三部分:以APAP致HEI-OC1听神经细胞损伤为耳损伤研究的细胞模型,通过MTT法、细胞形态学观察、流式细胞仪检测法检测细胞存活及凋亡情况、荧光定量PCR检测Mcll、Casp3、Bcl2等基因的表达。结果 第一部分:利用数据库共筛选到28个何首乌活性成分,420个活性成分靶点,159个耳鸣耳聋的疾病靶点;通过构建韦恩图,得到10个交集靶点;拓扑分析发现关键活性成分主要包括二苯乙烯苷（TSG）、大黄素、胡萝卜苷、大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷等;通过构建PPI网络,筛选得到10个关键靶点CASP3、CCND1、IL2、IL1B、IL6、CSF2、JAK2、IL1A、BCL2和COMT;GO功能分析发现其BP、MF主要与细胞因子活性、生长因子活性等有关;KEGG通路分析发现主要与JAK-STAT信号通路、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路等有关。然后构建了药物-活性成分-靶点-通路网络。并对主要活性成分和靶点进行分子对接,结果显示,大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷、TSG、胡萝卜苷、大黄素为何首乌保护耳损伤的主要药效物质基础,JAK2、CCND1、CSF2、IL2、IL1B、CASP3、BCL2等基因为何首乌耳损伤保护作用的主要靶基因。第二部分:ABR测试在第14天TSG实验组对比模型组听力阈值显著降低,测试频率为8 kHz时差异显著（P＜0.05）,DPOAE测试,实验组对比模型组,频率为16 kHz时差异显著（P＜0.05）;ASR,实验组对比模型组,各频率无统计学意义（P＞0.05）,gap-PPI,实验组对比模型组,在10 ms时差异显著（P＜0.05）,在40 ms时差异更加显著（P＜0.01）;对耳蜗毛细胞进行观察,实验组与模型组比较,外毛细胞排列整齐,细胞无缺失,内毛细胞排列基本整齐;豚鼠肝组织病理学观察,实验组豚鼠中央静脉周围的肝细胞排列紊乱,肝细胞胞浆疏松、透明,细胞核溶解、固缩,较模型组损伤更为严重;肾组织病理学观察,实验组豚鼠肾小管腔扩张、模糊,与模型组损伤相似。第三部分:细胞存活率实验表明,10μmol/L TSG可显著促进HEI-OC1耳蜗毛细胞增殖,增殖率为121.8%,细胞状态最佳,细胞形态饱满,细胞存活率高于其他浓度给药组,且高于模型组,略低于正常组。流式细胞仪检测表明,10 μmol/L TSG组细胞凋亡率为16.0%,APAP组细胞凋亡率为25.5%;qPCR检测相关基因表达,结果发现,与正常组比较,模型组HEI-OC1细胞Birc5表达水平有所下降,20 μmol/L TSG处理组表达水平明显升高。结论 大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷、TSG、胡萝卜苷、大黄素为何首乌保护耳损伤的主要药效物质基础,JAK2、CCND1、CSF2、IL2、IL1B、CASP3、BCL2等具有较好的靶向作用,通过分子对接技术验证了主要成分和核心靶点结合的可能性,说明何首乌可能通过多种化合物作用于多靶点和多通路共同实现治疗耳鸣耳聋的作用;TSG可以降低APAP损伤豚鼠的ABR、OAE听力阈值及抑制惊跳反射（PPI）,实验组豚鼠每天注射TSG 15 mg·kg-1与APAP 100 mg·kg-1连续14天后,发现何首乌苷具有肝毒性而肾毒性不明显;细胞学实验表明,何首乌苷可促进耳蜗毛细胞HEI-OC1细胞增殖,降低经APAP损伤后HEI-OC1细胞的凋亡,对APAP损伤产生相应的保护作用,可能通过Birc5基因及其相关通路进行APAP诱导损伤的保护作用,且确定TSG保护HEI-OC1细胞最佳浓度范围应为5-20 μmol/L之间。