昆虫生长与发育受蜕皮激素(20-hydroxyecdysone,20E)和保幼激素(Juvenile hormone,JH)的协同调控。其中,20E与胞内受体复合物EcR/USP结合后,再依次激活一系列初级应答基因和次级应答基因表达,继而由次级应答因子调控与生长发育直接相关的靶基因的表达,最终控制昆虫生长与发育。转录因子Broad Complex(BR-C)是20E的初级应答基因之一,包含一个BTB结构域和两个锌指结构域,属于BTB-ZF类蛋白,其中BTB结构域的主要作用是介导蛋白-蛋白互作。前期研究中,我们以家蚕BR-C的BTB结构域为诱饵,通过酵母双杂交扫描方法筛选到参与蛋白激酶C(PKC)磷酸化作用的活化激酶C受体1(Receptor for activated C-kinase 1,RACK1)是BR-C的潜在互作蛋白,暗示昆虫BR-C可能受到PKC的磷酸化修饰。因此,深入解析BR-C的磷酸化修饰及其作用将有助于完善昆虫蜕皮激素的信号传导网络。鉴于BR-C是含BTB结构域的BTB基因家族成员,本研究首先通过在基因组层面鉴定和比较家蚕等昆虫中的BTB基因家族进一步分析了昆虫BR-C的进化。同时,综合利用生物信息分析、质谱鉴定以及生物化学与分子生物学实验等多种方法策略,探究了BTB结构域在PKC激酶对家蚕BR-C磷酸化修饰中的作用,并进一步分析了蛋白激酶A(PKA)介导的磷酸化修饰对家蚕BR-C转录调控活性的影响以及20E对BR-C磷酸化的调节。获得的主要结果如下:1.家蚕BR-C与其他BTB基因家族成员的比较基因组学分析家蚕等昆虫的BR-C转录因子含有一个介导蛋白互作的BTB结构域。为了更好地了解昆虫BR-C基因的进化,我们首先对家蚕基因组中含BTB结构域的BTB基因家族进行了鉴定。以家蚕BR-C的BTB结构域序列为基序对家蚕基因组预测基因集进行BLAST检索发现,家蚕基因组中有56个BTB基因,其中53个BTB基因能定位到染色体上。按结构域组成不同,家蚕BTB蛋白可分类为只含BTB结构域的BTBD亚家族,以及还含其他结构域类型的8个亚家族,包括BBK(含BACK和Kelch)、KBTB(含Kelch)、BBTB(含BACK)、BBP(含BACK和PHR)、ZBTB或BTB-ZF(含Zinc finger)、HBTB(含HTH)、MBTB(含MATH)和ABTB(含ANK)。其中,BTBD和ZBTB亚家族所含的成员数目较多;BR-C属于BTB-ZF类,其编码基因统一命名为ZBTB6。遗传发生关系分析显示,BBK、BBP同来源于BTB-ZF亚家族的ZBTB14、ZBTB15和ZBTB16聚类较为紧密,暗示这些基因可能是在昆虫进化过程中通过复制产生并且发挥了相似生物学功能。进一步的比较分析显示,果蝇、蜜蜂、赤拟谷盗和帝王蝶分别含44、46、55和53个BTB基因。13个BTB基因在家蚕、果蝇、蜜蜂、赤拟谷盗和帝王蝶间呈1:1:1:1:1的直系同源关系,例如BR-C基因,暗示这些基因在昆虫进化过程中具有保守的功能。分析家蚕全基因组表达芯片数据和RT-PCR结果发现,家蚕BR-C(ZBTB6)基因在幼虫5龄第3天各组织中的表达无明显性别偏好性和组织特异性,但在变态发育期间主要在预蛹前及化蛾前高表达;部分家蚕BTB基因在5龄第3天幼虫各组织中的表达具有性别偏好性,或在变态发育过程呈现阶段特异性。2.家蚕BR-C与PKC磷酸化通路关键因子RACK1的互作激活其转录调控活性1)BR-C与PKC信号通路的锚定蛋白RACK1发生蛋白互作我们之前以家蚕BR-C转录因子的BTB结构域为诱饵,通过酵母双杂交筛选初步发现,BR-C的BTB结构域能与PKC信号通路的关键锚定蛋白RACK1发生蛋白互作。以此为基础,本研究进一步通过多种实验策略对家蚕BR-C与RACK1之间的蛋白互作进行了证实。首先,酵母双杂交结果显示,完整BR-C或单独BTB结构域均可与RACK1互作,而删除BTB结构域的BR-C则不能与RACK1互作。其次,far-western blot和GST pull-down分析表明,原核表达的带标签的重组蛋白SUMO-BR-C同GST-RACK1存在相互作用。上述结果表明,家蚕BR-C通过其BTB结构域与RACK1发生蛋白互作。2)BR-C与RACK1的蛋白互作介导PKC对BR-C的磷酸化并影响BR-C入核我们的前期研究还发现,家蚕BR-C作为转录因子定位于细胞核,而参与PKC对靶蛋白磷酸化修饰的RACK1主要定位于细胞质。为探究BR-C与RACK1互作的潜在功能,我们在家蚕卵巢来源的BmN4细胞中开展了BTB结构域删除的不完整BR-C基因的过表达以及内源性RACK1基因的RNA干涉(RNAi)。结果显示,无论是内源RACK1的RNAi还是BTB结构域删除都导致家蚕BR-C不能进入细胞核,而是定位于细胞质中,暗示BR-C与RACK1的蛋白互作控制了BR-C的正常入核。鉴于RACK1主要参与调控PKC对其互作蛋白的磷酸化修饰,继而影响互作蛋白的亚细胞定位,我们猜测RACK1与BR-C的互作可能与PKC对BR-C的磷酸化有关。为证实该猜想,我们首先对BmN4细胞中内源的PKC基因进行了RNAi,发现PKC的RNAi同样导致BR-C不能入核。进一步在线预测发现,家蚕BR-C蛋白有12个潜在的PKC磷酸化位点。对这些位点分别进行定点突变实验显示,只有当Ser373和Thr406这两个位于锌指结构域的氨基酸残基突变为阻断磷酸化的Ala(S373A和T406A)形式时才抑制BR-C的入核;当突变为模拟其磷酸化的Glu(S373E和T406E)形式时,即使删除BR-C的BTB结构域也不影响BR-C的核定位。综合分析推测,家蚕RACK1通过与BR-C的互作来介导PKC对BR-C的Ser373和Thr406位点的磷酸化修饰,从而决定BR-C入核。3)PKC介导的BR-C的磷酸化激活其转录调控活性转录因子的磷酸化修饰通常与其转录调控活性有关。为探究PKC对BR-C的Ser373和Thr406位点的磷酸化是否影响其转录调控活性,我们选择直接受家蚕BR-C激活转录的靶基因WCP10(翅特异表皮蛋白10)的启动子开展了双荧光素酶报告基因实验。结果显示,删除BTB结构域的BR-C完全丧失了对WCP10启动子的激活作用,而针对PKC磷酸化位点Ser373和Thr406的失活突变也显著降低了BR-C的转录激活作用。综合分析表明,BR-C与RACK1的蛋白互作调控了PKC对BR-C的磷酸化,从而引起BR-C入核并激活其转录调控活性。3.PKA对家蚕BR-C的磷酸化抑制其转录调控活性1)BR-C的Ser186位点发生PKA磷酸化修饰我们基于液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)分析方法对家蚕BR-C中发生磷酸化修饰的位点进行了鉴定。首先,利用家蚕BR-C抗体对来源于家蚕幼虫5龄第3天脂肪体以及过表达BR-C的家蚕胚胎来源的BmE细胞的总蛋白进行western blot发现,在BR-C分子量附近能检测到两条紧邻的信号带,分子量较大的条带可能是BR-C的磷酸化形式,而分子量较小的可能是其非磷酸化形式。通过LC-MS/MS分析发现,第186位丝氨酸(Ser186)是家蚕BR-C蛋白中的一个潜在磷酸化位点。我们针对家蚕BR-C的Ser186位点制备了磷酸化抗体;通过对Ser186位点进行定点突变以及利用蛋白磷酸酶λ-PP对过表达家蚕BR-C的BmE细胞总蛋白进行处理,均导致BR-C的Ser186位点的磷酸化水平降低,表明家蚕BR-C的Ser186位点受到磷酸化。在线预测发现,家蚕BR-C的Ser186残基是PKA的潜在磷酸化位点。进一步的实验表明,利用PKA的特异性激活剂cAMP(环腺苷酸)和forskolin分别处理过表达家蚕BR-C的细胞可显著上调Ser186位点的磷酸化水平,而用PKA的特异性抑制剂H89和KT5720处理则显著下调Ser186位点的磷酸化水平。个体水平的实验结果与细胞水平的结果完全一致。这表明家蚕BR-C的Ser186位点受到PKA的磷酸化。2)PKA对BR-C的磷酸化不影响其核定位但抑制其转录调控活性为了解析PKA介导的BR-C磷酸化的潜在作用,我们将BR-C的Ser186定点突变为Ala(S186A)以阻断其磷酸化,以及突变为Glu(S186E)以模拟其磷酸化形式。家蚕BmE细胞中的实验表明,S186A和Ser186E突变及PKA特异性抑制剂处理均不改变BR-C的细胞核定位。考虑到家蚕WCP10及Ser1(丝胶1)基因的转录分别受到BR-C的诱导和抑制,我们进一步利用这两个基因的启动子来研究PKA介导的磷酸化对BR-C转录调控活性的影响。BmE细胞中的双荧光素酶报告基因实验表明,与对照相比,S186A突变对WCP10和Ser1启动子的活性分别具有促进和抑制作用,而S186E突变对WCP10和Ser1启动子的活性却没有明显影响;PKA激活剂cAMP和forskolin可以显著抑制BR-C对WCP10启动子的转录激活活性。进一步的凝胶阻滞分析(EMSA)和染色质免疫共沉淀(Ch IP)实验证明,Ser186位点的磷酸化导致BR-C失去了对靶DNA序列的结合能力。这些证据表明,PKA对BR-C的磷酸化不影响其核定位,但可以通过消除其与靶DNA序列的结合能力而抑制其转录调控活性。3)20E通过抑制cAMP/PKA信号通路活性来抑制BR-C的磷酸化20E对昆虫BR-C基因的转录具有激活调控作用。我们进一步分析了20E对PKA介导的BR-C磷酸化是否存在影响。实验结果显示,用20E对家蚕预蛹期脂肪体以及过表达家蚕BR-C的BmE细胞分别进行持续处理,都可导致BR-C的Ser186位点的磷酸化水平发生下调。此外,我们发现20E对cAMP/PKA信号通路也有影响,即持续的20E信号不仅可抑制细胞内cAMP合成,还可降低PKA之催化亚基PKA-C的磷酸化水平,并抑制PKA靶蛋白CREB的磷酸化。综合分析表明,PKA对BR-C的磷酸化抑制了BR-C的转录调控活性,而持续的20E信号则通过抑制cAMP/PKA信号通路的活性来抑制PKA对BR-C的磷酸化。