蛋白质组学研究主要依赖三大技术：蛋白质分离技术、蛋白质鉴定技术以及生物信息学技术即对鉴定的蛋白质进行结构和功能分析与预测。蛋白质组学的发展既为技术所推动也受技术所限制,蛋白质组学研究成功与否,很大程度上取决于其技术方法水平的高低,因此发展更新和更有效的蛋白质分析方法是当今乃至未来相当长一段时间内蛋白质组学研究的主要任务之一。在本论文里,我们对膜蛋白质组学研究进行了一系列的方法学探索。生物膜是细胞结构的重要成分,在细胞器分隔和保护细胞免受外部有害因素的伤害等许多方面起着十分重要的作用。生物膜的功能主要由膜蛋白来执行,据报道在细胞的总蛋白质中膜蛋白质大约占30%。它们整合于脂双层中或与脂膜结合,往往具有相当复杂的功能。所有的膜蛋白质中有超过一半的蛋白质被预测为药理学靶标。在膜蛋白质中,质膜蛋白质尤其重要,因为它们就像“门铃”和“通道”,在细胞基本的生物学过程中起着十分重要的作用,包括细胞与环境、细胞与细胞间的物质和能量交换以及信号的传导。然而,尽管膜蛋白质具有十分重要的生物学意义,但由于它们的疏水性强、丰度低,对于它们的研究远落后于可溶性蛋白质,目前仍然存在很大的挑战。大部分膜蛋白质在水溶液中的溶解性差,从而限制了它们的溶解、提取、酶解和鉴定。因此,如何进行膜蛋白样品的制备以及质谱分析是一个值得探讨的课题。脱氧胆酸钠(sodium deoxycholate, SDC)是一种天然的强阴离子去垢剂,以较高的浓度存在于哺乳动物的胆汁中。我们在前期工作中通过MALDI-TOF MS分析已经证明,SDC能与胰蛋白酶活性兼容；而且与SDS比较,SDC能够更加有效地提高膜蛋白鉴定的可靠性。在本研究中,我们系统地研究了SDC在难酶解蛋白(肌红蛋白和整合膜蛋白)的溶解、酶解和鉴定中的应用。结果表明,当SDC的浓度为1%时胰蛋白酶的催化活性几乎未受影响；SDC浓度在2-5%时酶的活性仅仅下降约13.6%,即使是在10%SDC存在的情况下,胰蛋白酶依然能够保持77.4%的催化活性。我们用酸化处理后通过离心的方式将SDC从样品中去除,通过分析MALDI-TOF质谱图中的离子峰数量和信噪比证实。与蛋白质组学研究中除SDS外的另外两种常用添加剂尿素和甲醇比较,SDC能够更加有效地促进蛋白质尤其是难酶解蛋白质(如结构紧凑的肌红蛋白和疏水性强的整合膜蛋白)的变性、溶解和酶解,从而提高了其鉴定效率；鉴定蛋白质和特异肽段的数量以及序列覆盖率均得到提高,说明SDC在膜蛋白质组的鸟枪法分析中具有重要的应用价值。与许多其它去垢剂不同,SDC不会干扰酶解后样品的LC-MS/MS分析,因为可以通过酸化后离心(acid precipitation, AP)或有机溶剂如乙酸乙酯萃取(phase transfer, PT)的方法将SDC从样品中去除。为了进一步评估SDC在膜蛋白质组学研究中的应用价值,我们比较研究了从样品中去除SDC的两种方法对酶解多肽回收和蛋白质鉴定效果的影响。研究结果显示,AP和PT这两种方法都会导致一定数量酶解肽段的损失,而且PT方法在SDC去除的过程中会损失更多的肽段；但是,可以通过分别洗涤酸沉淀和相转移时有机相固形物来回收大部分的损失肽段。通过对损失肽段的回收,膜蛋白质尤其是跨膜蛋白质和低丰度蛋白质的鉴定效率得到了显著的提高。相对而言,加上回收损失肽段的步骤后,AP方法优于PT方法,这是因为与后者相比前者不仅能够得到更好的鉴定效果,而且更加经济、安全,也更易于实际操作。前面的研究已经证明了SDC是适合于膜蛋白质组鸟枪法分析的一种去垢剂。但是我们在实验过程中发现它在溶解膜片和提取膜蛋白的能力上还有其局限性,始终有一部分膜片难以完全溶解,这是因为它是一种甾体化合物,由一个极性面和一个非极性面构成,而不是一种典型的线型头尾结构。这种面两亲性结构在抽提、溶解和变性膜蛋白方面具有一定的局限性,因此寻找一种更合适的去垢剂,既能很好地抽提和溶解膜蛋白,又能很好地与蛋白酶活性以及质谱分析兼容,是很有意义的工作。从分析比较SDS和SDC的分子结构人手,我们筛选了一些去垢剂,最后推测月桂酸钠(Sodium laurate, SL)应当具有很强地促进膜蛋白质组鸟枪法分析的潜力,因为它具备一个典型的线性头尾结构：含有一个类似SDS的长的疏水性烃链的同时又含有一个类似SDC的亲水性头部(羧基),有利于其在LC-MS/MS分析前酸化除去。通过一系列的比较实验,我们发现它不仅有较强的裂解膜片和提取膜蛋白质的能力,而且在0.1%浓度下,对胰蛋白酶的活性有促进作用。同时我们分析发现相转移的方法能有效地将SL从样品中去除,保证了肽段质谱分析的效果。最后,将SL应用于标准膜蛋白和大鼠肝脏质膜富集样品蛋白质的酶解和鉴定,结果表明,与ALS和SDC辅助法相比,SL辅助法更有利于膜蛋白质尤其是强疏水性和多跨膜区蛋白质的分析鉴定。由于目前大多数的蛋白质组学研究策略对于完整蛋白质的直接分析有其局限性,所以蛋白质的酶解和可检测肽段的制备对蛋白质鉴定是至关重要的。在蛋白质组学研究中,蛋白质经凝胶电泳分离后再进行胶内酶解是最常用的制备肽段的技术路线,但胶内酶解存在的固有缺点就是蛋白质尤其是疏水性强的膜蛋白质酶解不完全和酶解肽段回收率低,从而影响蛋白质鉴定的成功率和可信度。在本研究中,我们提出了一种能有效促进蛋白质酶解和酶解肽段回收的新方法。研究中通过电转移的方法将凝胶电泳分离的蛋白质转移到PVDF膜上,然后从PVDF膜上切下目的蛋白,再用高纯度的DMF(≥99.8%)溶解蛋白条带。在胰蛋白酶酶解之前,加入一定量的碳酸氢铵缓冲液来适当地调节DMF的浓度(至40%),使得胰蛋白酶能够显示活性。标准蛋白的实验结果证明,由于DMF能够溶解PVDF膜和与膜结合的蛋白质,因此蛋白质实际上是在含DMF的缓冲液中进行溶液酶解。此方法能够得到更高的酶解效率和肽段回收率,从而能够提高蛋白质鉴定的序列覆盖率和可信度。以富集的大鼠海马膜蛋白为样品进行的比较实验结果表明,本方法与文献报道的膜上酶解方法相比,在蛋白质鉴定方面具有明显优势,提高了蛋白质包括低丰度和／或高疏水性膜蛋白的鉴定效率。