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刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)简称弓形虫是专性细胞内寄生虫。它可引起严重的人畜寄生虫病并呈全球性分布及流行。弓形虫的终末宿主是猫及猫科动物,但是其中间宿主包括的动物种属却较多,其中猪就是其中间宿主之一,并且猪弓形虫的感染率及死亡率也较高。在我国猪弓形虫病的分布地区也较广,猪肉在我国的消费比例较高,已经成为人感染弓形虫的重要来源。这就给养猪业和人类健康造成严重的危害。但目前对弓形虫病还没有特效的治疗药物和有效疫苗。因此,建立一种方便、快捷的猪弓形虫病诊断方法尤为重要。目前用于弓形虫病诊断的方法有很多,如病原学诊断(检测结果确实、可靠,但是耗时、检出率低)、分子生物学诊断(敏感性高,但对仪器、人员要求较高)和免疫学诊断(操作简单、敏感特异、结果判定直观)。本研究应用免疫学诊断方法对弓形虫病进行检测其主要研究内容及结果如下:1.弓形虫SAG3成熟肽基因的克隆、原核表达及鉴定根据Gen Bank AF340227已经发表的弓形虫表面抗原SAG3基因序列设计一对特异性引物,PCR扩增SAG3基因片段。经Eco R?、Hind???双酶切后克隆到原核表达载体p ET-28a中,构建重组表达质粒p ET-28a-SAG3并将其转化至BL21中,经IPTG诱导表达,表达产物通过SDS-PAGE显示p ET-28a-SAG3主要以包涵体的形式存在。Western blotting分析该重组蛋白能被猪弓形虫阳性血清识别,反应原性较好。2.猪弓形虫抗体间接ELISA检测方法的建立及初步应用利用纯化的SAG3蛋白作为包被抗原建立间接ELISA方法,并对反应条件进行优化,优化结果显示:最佳蛋白包被浓度为31.25ng/孔,以5%脱脂奶粉为最佳封闭剂,被检血清稀释度为1:320,酶标二抗最佳工作浓度为1:3000。该方法的灵敏性试验中,血清稀释度在1:6400时仍判为阳性;该方法批内、批间重复的变异系数分别小于3%,12%重复性较好;采用该方法对8份阳性血清进行检测均为阳性,对吉林地区某猪场94份猪的待检血清以及广东地区某猪场54猪血清进行检测,阳性率分别为8.51%(8/94)、46.29%(25/54)。3.猪弓形虫感染双抗夹心ELISA检测方法的建立与初步应用利用实验室已制备的抗弓形虫重组蛋白SAG3单克隆抗体(Anti-A-SAG3-7和Anti-A-SAG3-23)建立双抗夹心ELISA方法并对各个反应条件进行优化。结果显示:Anti-A-SAG3-7作为捕获抗体包被的最佳稀释度为1:3200,猪弓形虫循环抗原(CAg)阳性参照血清的最佳稀释度为1:80,最佳封闭液为1%BSA,HRP-Anti-A-SAG3-23的最佳稀释倍数为1:3200。该方法敏感性达1:640,并且此方法与两份猪囊虫阳性血清无交叉反应,计算批内、批间变异系数均小于11%,表明所建立的双抗夹心ELISA方法具有良好的敏感性、特异性和重复性。检测广东、吉林某地各94份待检血清,结果阳性率分别为20.2%(19/94)、11.7%(11/94)。4.猪弓形虫感染免疫胶体金试纸条的研制及初步应用利用柠檬酸三钠还原法制备40nm粒径的胶体金溶液,标记抗弓形虫重组蛋白SAG3的单克隆抗体(Anti-A-SAG3-7)并对其标记条件进行优化,用另一株抗SAG3的单克隆抗体(Anti-A-SAG3-23)和羊抗小鼠Ig G抗体分别包被硝酸纤维素膜上的检测线(T线)与质控线(C线)。组装试纸条并优化其检测条件。对试纸条的性能进行测试并检测待检样品。结果如下:每毫升胶体金溶液的最适PH值是加入4μl 0.2M/L K2CO3,抗体的最佳标记量为12μg。T线与C线的最佳包被浓度均为0.25mg/m L,最佳包被体积均为0.8μl。该方法的敏感性达1:160;与两份猪囊虫阳性血清无交叉反应;稳定性试验结果表明,试纸条置于4℃和室温分别可保存3个月、1个月有效。分别对广东、吉林地区某猪场各94份猪待检血清进行检测,阳性率分别为18.08%(17/94)、10.63%(10/94)。利用胶体金试纸条与双抗夹心ELISA法做对比检测同一批样品,两者的符合率分别为89.47%,90.90%,两种方法的符合率较高。结果表明,胶体金免疫层析法具有敏感、特异,操作简单等优点。因而,本研究更适用于广大基层单位对时间紧、样品数量大的检测,为猪弓形虫病的早期诊断提供了一种快捷、实用的方法。