【摘 要】
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成簇规则相间的短回文重复(CRISPR/Cas)系统是近年新兴的一项RNA介导的核酸酶靶向基因编辑技术。本研究利用该系统对水稻中5个功能未知的OsGRF(Growth-Regulating Factor)基
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成簇规则相间的短回文重复(CRISPR/Cas)系统是近年新兴的一项RNA介导的核酸酶靶向基因编辑技术。本研究利用该系统对水稻中5个功能未知的OsGRF(Growth-Regulating Factor)基因家族成员(OsGRF3/7/8/9/11)进行定点突变试验,构建了基因敲除株系,并从突变效率、类型及它们的合子型3个方面对试验数据进行了比较分析。主要结果如下:1、突变效率。在5个靶基因OsGRF3/7/8/9/11的T0代中,敲除植株占总植株的比例分别是22/25、38/47、22/22、12/16和22/22,突变株频率在75.0—100.0%之间,体现了该技术对水稻基因定点敲除的高效性。实验中采用玉米ZmUbi的启动子驱动水稻密码子优化的Cas9蛋白的表达,同时由水稻OsU6启动子驱动gRNA的表达。推测可能正是这些核心组分的改造提高了靶向编辑的效率。2、突变类型。T0代靶标位点上绝大多数(约95%)发生≤3 bp的短片段缺失或插入突变,其中1 bp插入碱基组分多偏好于T和A(占89.3%),说明Cas9/gRNA复合体造成的DNA双链断裂可能多由内源NHEJ途径介导易错修复,从而形成以短片段为主的突变发生。同时,不同靶点所处的微环境中4种碱基的配比应该是各异的,这种差异可能是导致不同突变方式发生的限制因素之一。3、合子型。在T0代132株突变株中,双等位基因突变株为87株,其中复合杂合体59株,表明这种定点突变作用多数可能在植物受体细胞的早期分裂活动中就已发生。此外,对OsGRF7/8部分株系T1代的基因型分离比进行检测,发现这些合子型的遗传基本遵循孟德尔定律。本研究结果展现了CRISPR/Cas系统在水稻基因组定点编辑上的有效性,并为深入展开OsGRF基因的功能研究提供了有价值的材料。
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