【摘 要】
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目的:顺铂是临床上常用的治疗癌症的广谱类药物,但是它引起的耳毒性作用目前没有预防或治疗的有效措施。耳蜗螺旋神经节神经元（Spiral ganglion Neurons,SGNs）是声音信息传递至中枢神经系统的重要枢纽,同时也是顺铂诱导感音神经性听力损失的重要区域之一。本实验用C57/6J小鼠通过腹腔注射的方式建立顺铂耳毒性模型,观察顺铂诱导C57BL/6J小鼠耳蜗螺旋神经节神经元凋亡与Cav1.2
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目的:顺铂是临床上常用的治疗癌症的广谱类药物,但是它引起的耳毒性作用目前没有预防或治疗的有效措施。耳蜗螺旋神经节神经元（Spiral ganglion Neurons,SGNs）是声音信息传递至中枢神经系统的重要枢纽,同时也是顺铂诱导感音神经性听力损失的重要区域之一。本实验用C57/6J小鼠通过腹腔注射的方式建立顺铂耳毒性模型,观察顺铂诱导C57BL/6J小鼠耳蜗螺旋神经节神经元凋亡与Cav1.2的关系,并探讨Cav1.2是否是是顺铂诱导耳蜗螺旋神经节神经元凋亡的靶点。方法:动物实验:选取8周龄雄性C57BL/6J小鼠分为对照组（Control）;顺铂给药1周期组（Cycle 1）、顺铂给药2周期组（Cycle 2）、顺铂给药3周期组（Cycle 3）。听性脑干反应（Auditory brainstem response,ABR）检测各组小鼠听力阈值变化;超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）以及丙二醛（Malonaldehyde,MDA）试剂盒检测各分组耳蜗组织的SOD活性和MDA含量;苏木精-伊红HE染色观察各组小鼠耳蜗螺旋神经节形态学变化;TUNEL染色检测各组耳蜗螺旋神经节凋亡情况;免疫荧光观察Cav1.2与Caspase-3的分布与表达。原代培养螺旋神经节神经元并将细胞实验分为五组:对照组（Control）、溶剂组（DMSO）、Cav1.2阻断剂组（N）、顺铂组（Cisplatin）、顺铂与Cav1.2阻断剂共同孵育组（Cisplatin+N）。Hoechst33342染色观察各组凋亡情况,流式细胞术检测各组凋亡率,Western Blotting检测Cav1.2蛋白表达以及相关凋亡蛋白的表达,钙离子探针检测细胞内钙离子浓度变化,JC-1检测膜电位变化,Mito SOX检测线粒体释放ROS情况。结果:1.动物实验:（1）ABR检测结果显示:Cycle 2组与Cycle 3组的听力阈值明显升高（P＜0.01,n=6）;（2）耳蜗组织SOD活性以及MDA含量检测结果显示:Cycle 2组与Cycle 3组检测耳蜗组织SOD活性均降低（P＜0.05,n=3）,MDA含量均增高（P＜0.05,n=3）;（3）HE染色结果显示:Cycle 2组出现明显空泡,细胞质肿胀,与Control组相比细胞密度减小（P＜0.05,n=4）,Cycle 3组损伤加重,密度明显减小（P＜0.01,n=4）;（4）TUNEL染色结果显示:Cycle 2组与Cycle 3组耳蜗SGNs凋亡率均升高（P＜0.05,P＜0.01,n=4）。（5）免疫组化结果显示:Cycle 2组与Cycle 3组小鼠SGNs上Caspase-3表达明显增加（P＜0.01,n=4）,Cycle 3组Cav1.2表达明显升高（P＜0.01,n=4）;2.细胞实验:（1）通过CCK8选择5μmol/ml培养12h用于后续实验的干预;（2）Western blot结果显示:顺铂上调SGNs中Cav1.2蛋白表达（P＜0.05,n=3）;（3）Hoechst33342染色与流式细胞术结果显示:顺铂干预明显上调SGNs凋亡率（P＜0.01,n=3）,而加入Cav1.2阻断剂降低了SGNs凋亡率（P＜0.05,n=3）;（4）Western blotting结果显示:顺铂上调SGNs中促凋亡蛋白Cleaved-caspase-3、Bax蛋白水平（P＜0.01,P＜0.001,n=3）,下调抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白水平（P＜0.01,n=3）,加入Cav1.2阻断剂Cleaved-caspase-3、Bax蛋白水平降低（P＜0.05,n=3）,Bcl-2蛋白水平升高（P＜0.05,n=3）;（5）钙探针结果显示:顺铂上调SGNs胞内钙离子浓度（P＜0.01,n=3）,加入Cav1.2阻断剂后胞内钙离子浓度减小（P＜0.05,n=3）;（6）Mito SOX结果显示:顺铂上调SGNs线粒体ROS释放（P＜0.001,n=3）,Cav1.2阻断剂下调SGNs线粒体ROS释放（P＜0.05,n=3）;（7）JC-1结果显示:顺铂明显下调SGNs线粒体膜电位（P＜0.01,n=3）,加入Cav1.2阻断剂后SGNs线粒体膜电位升高（P＜0.05,n=3）。结论:顺铂可能通过上调Cav1.2促进钙内流,进而使线粒体ROS增多,引起SGNs氧化应激损伤从而诱导线粒体途径的细胞凋亡。
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