论文部分内容阅读
有机磷农药的大量使用在消灭害虫确保农业生产的同时,环境中残留的农药给人类健康带来许多危害。快速、有效的清除环境中的农药残留已成为目前研究的热点。从污染环境中分离筛选高效降解菌,利用微生物对残留农药进行生物降解,是修复农药污染环境的重要手段之一。本研究从活性污泥中分离获得一株毒死蜱高效降解菌YC-YH1,该菌株能够利用毒死蜱为唯一磷源生长。通过显微镜和电镜扫描观察确定菌株YC-YH1的形态特征、结合Biolog微生物鉴定系统和16S r RNA基因序列分子进化分析,鉴定菌株YC-YH1为施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)。利用响应面法研究菌株YC-YH1的最适降解条件,结果表明:菌株YC-YH1的最适降解条件为培养温度32℃、培养基p H 7.3,菌种的初始接种量12.0 mg/L,在优化条件下培养4天,可将100 mg/L毒死蜱完全降解。在发酵条件下,菌株YC-YH1可耐受并降解高达400 mg/L的毒死蜱。降解底物谱分析发现,YC-YH1对有机磷农药、拟除虫菊酯类农药、多环芳烃化合物具有一定的降解能力。运用高效液相色谱-质谱联用技术检测菌株YC-YH1在无磷培养基中降解毒死蜱所产生的代谢产物和生物表面活性剂,推测出可能的代谢途径和生物表面活性剂的组成成分。本研究采用Illumina Hiseq2000测序平台对菌株YC-YH1的基因组进行测序,并对基因组数据进行生物信息学分析。基因组测序分析表明菌株YC-YH1中同时含有有机磷降解酶基因mpd和oph C2,含有编码鞭毛、细菌趋化性所需的全部基因,同时含有萘、菲等物质的降解途径中部分所需酶的基因,这与菌株鉴定和降解特性研究结果相一致。菌株中含有较多的编码分泌系统蛋白的基因和编码生物膜组成蛋白的基因,具有特殊代谢能力和生物修复应用潜力。这为研究菌株对外源化合物的代谢途径及调控网络提供了研究基础。荧光差异双向凝胶电泳分析施氏假单胞菌YC-YH1在毒死蜱诱导条件下的蛋白质表达差异,通过差异比较和统计分析,获得377个差异蛋白质点,其中113个差异蛋白质点的丰度上升,264个差异蛋白质点的丰度下降。在胁迫条件下,YC-YH1菌株中含有的有机磷降解酶MPH和OPHC2都是诱导性表达。选择20个与农药胁迫相关蛋白的基因进行荧光定量PCR验证,检验其在转录水平上的表达情况,验证结果表明其中有18个基因的表达趋势与蛋白质组结果相一致,另外2个基因的表达趋势相反。从菌株YC-YH1的基因组中克隆到42个Lys R型调控蛋白的编码基因,并对这些蛋白进行表达和纯化。利用Biacore T200生物大分子相互作用系统筛选mpd基因的调控蛋白,得到一种能够与mpd基因启动子序列相互作用的调控蛋白Lys R1661,利用凝胶阻滞实验验证该调控蛋白与mpd启动子序列结合的特异性。