抑制素2(Prohibitin 2,PHB2)是一种进化上高度保守的蛋白,其在真核细胞中广泛表达,通常与PHB1结合形成复合体,负责维持线粒体结构与功能,参与调控细胞增殖、分化、凋亡等多种生物学行为。目前,已有研究显示PHB2与肿瘤的发生、发展有关,但PHB2在肿瘤中的作用及分子机制还未完全阐明。横纹肌肉瘤(Rhabdomyosarcoma,RMS)是最常见的小儿软组织肿瘤之一,起源于原始间叶细胞,发病率约占小儿软组织肉瘤的50%。横纹肌肉瘤表达肌源性促分化转录因子,但却不能完成终末分化。我们的前期研究表明PHB2负调控肌肉促分化转录因子(如MyoD和MEF2)的活性,从而对成肌细胞的分化进程具有明显的抑制作用,那么PHB2是否在横纹肌肉瘤发生、发展中发挥一定的作用?鉴于此,本文对PHB2在横纹肌肉瘤细胞中的功能及作用机制进行了系统研究。此外,我们的初步研究结果表明PHB2在部分肿瘤细胞及其对应的正常细胞中可能存在着亚细胞定位和生物学作用上的差异,为了进一步探讨这种差异,我们利用肝癌和正常肝细胞系对PHB2在正常细胞和癌变细胞中的生物学作用进行了初步的对比研究。为了研究PHB2在横纹肌肉瘤细胞增殖和分化过程中的作用,我们采用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术抑制内源性PHB2的表达,以分析PHB2对横纹肌肉瘤细胞增殖及分化的调控作用,并探讨其中的作用机制。首先,我们采用MTT法检测干扰PHB2表达对横纹肌肉瘤细胞系的细胞活力的影响,结果发现PHB2表达下调明显降低了横纹肌肉瘤细胞的细胞活力。为了进一步明确横纹肌肉瘤细胞细胞活力的下降是否与细胞增殖受到抑制有关,我们分别采用BrdU掺入法检测了细胞的DNA合成能力,免疫荧光染色法检测了细胞增殖标志物Ki67的阳性率以及分析了细胞的平板克隆形成能力。结果表明PHB2表达下调明显降低横纹肌肉瘤细胞DNA合成能力,并导致Ki67阳性细胞数显著减少及克隆形成能力下降。以上结果提示PHB2表达下调可明显抑制横纹肌肉瘤细胞的增殖能力。为了进一步研究PHB2表达下调是否影响横纹肌肉瘤细胞的细胞周期及诱导细胞发生凋亡,我们采用流式细胞术和免疫印迹法分别分析了肿瘤细胞的细胞周期和凋亡以及周期蛋白的表达水平,结果发现PHB2表达下调导致横纹肌肉瘤细胞系RD细胞出现G1期阻滞,同时抑制了周期蛋白E(Cyclin E)的表达,并引起少量细胞凋亡。为了进一步分析PHB2对横纹肌肉瘤细胞分化的影响,我们采用免疫印迹及免疫荧光染色的方法检测了骨骼肌细胞分化标志分子成肌因子(myogenin)的表达,结果表明PHB2表达下调提高了横纹肌肉瘤细胞myogenin的表达水平及myogenin阳性细胞数,说明PHB2表达下调促进了横纹肌肉瘤细胞的分化。以上结果说明PHB2参与维持横纹肌肉瘤细胞存活、增殖及低分化状态。为了进一步探究PHB2参与调节横纹肌肉瘤细胞增殖和分化过程的分子机制,我们首先对之前发现的部分PHB2疑似细胞核核仁定位进行了确认。通过对横纹肌肉瘤细胞中的PHB2和核磷蛋白(nucleophosmin,NPM)进行免疫荧光共定位检测,我们发现,不同组织类型来源的多种横纹肌肉瘤细胞系中均有部分PHB2与NPM共定位于核仁,但在大鼠正常成肌细胞L6细胞中却未观察到PHB2的核仁定位。为了进一步研究PHB2核仁定位的普遍性和特异性,我们对人肝细胞癌细胞系HepG2、人乳腺癌细胞系MDA-MB-231、人卵巢癌细胞系A2780及人正常肝细胞系L02细胞进行了PHB2免疫荧光染色分析,结果发现MDA-MB-231细胞和A2780细胞中均未出现PHB2的核仁定位,而值得关注的是,PHB2在HepG2细胞中出现了核仁定位,在L02细胞中则无核仁定位。以上结果说明PHB2至少在包括横纹肌肉瘤及肝癌等在内的部分肿瘤细胞中存在着特异的细胞核核仁定位。鉴于部分PHB2明显定位于横纹肌肉瘤细胞的核仁中,而核仁的结构与功能与肿瘤的发生、发展密切相关,其介导的rRNA合成功能的增强是肿瘤细胞增殖的重要标志,因此接下来我们探究了PHB2表达下调对横纹肌肉瘤细胞核仁结构和功能的影响。透射电子显微镜观察横纹肌肉瘤细胞超微结构的结果显示,与对照组相比,PHB2表达下调后,横纹肌肉瘤细胞表现出核仁小且致密、边界不清,海绵状核仁消失等特征。同时采用实时定量PCR检测45S核糖体RNA(45S rRNA)和18S核糖体RNA(18S rRNA)的转录水平以分析核仁的功能,结果表明PHB2表达下调抑制横纹肌肉瘤细胞45S rRNA和18S rRNA的合成,说明PHB2参与调控核糖体DNA(rDNA)转录。有研究表明,转录因子Myc和肌肉特异性促分化转录因子成肌分化蛋白(Myoblast determination protein 1,MyoD)分别正或负调控rDNA的转录从而促进细胞增殖(Myc)或促进细胞分化(MyoD)。为了进一步揭示PHB2对rDNA转录的调节作用是否与这两种转录因子的活性有关,我们采用染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)检测PHB2表达下调是否影响转录因子Myc和MyoD与rDNA的结合,结果表明,PHB2表达下调明显抑制Myc与rDNA的结合,同时促进MyoD与rDNA的结合,这一结果与PHB2表达下调抑制rRNA合成的结果相一致,提示PHB2通过调节转录因子Myc和肌肉特异性转录因子MyoD对rDNA转录调控作用来促进横纹肌肉瘤细胞的rRNA合成。由于PHB2在部分肿瘤细胞及其对应的正常细胞中存在着核仁定位的差异,为了明确这种定位上的差异是否导致PHB2在肿瘤细胞和正常细胞中发挥不同的生物学作用,我们选用人肝细胞癌细胞系HepG2和人正常肝细胞系L02开展了对比研究。首先对比分析PHB2对正常肝细胞和肝细胞癌细胞活力的影响,MTT实验结果显示PHB2表达下调明显抑制了HepG2细胞的细胞活力,但对正常肝细胞L02则无明显影响。BrdU掺入实验亦显示PHB2表达下调降低了HepG2细胞的DNA合成能力,而对正常细胞L02无明显影响。细胞周期蛋白表达水平的免疫印迹分析显示PHB2表达下调可以抑制HepG2细胞而非L02细胞中细胞周期蛋白Cyclin E的表达,同时初步发现PHB2表达下调可以促进HepG2细胞中p27和p53的表达。这些结果说明PHB2在正常细胞和肿瘤细胞的增殖过程中可能发挥着不同的作用。进一步透射电镜分析超微结构显示PHB2表达下调导致HepG2细胞的核仁体积明显变小,而L02细胞的核仁结构则无明显改变。实时定量PCR分析rRNA水平亦显示PHB2表达下调可明显抑制HepG2细胞的rRNA合成,但对L02细胞的rRNA合成则无抑制作用,说明PHB2特异地对肝细胞癌细胞的rRNA合成至关重要。PHB2的线粒体定位普遍存在于几乎所有细胞,因此我们又对比分析了PHB2下调对正常肝细胞和肝细胞癌细胞ATP合成能力的影响,结果我们发现PHB2表达下调对HepG2细胞ATP合成的抑制作用高于L02细胞,但这仅是我们初步的研究结果,还需要进一步的研究进行确认。总之,在本研究中,我们首次确定部分PHB2特异地定位于部分肿瘤细胞的核仁,并参与维持核仁的结构,调控核仁的功能。在横纹肌肉瘤细胞中,PHB2具有促进细胞增殖,抑制细胞分化的作用,并参与维持横纹肌肉瘤细胞的核仁结构,及通过调节转录因子Myc和肌肉特异性转录因子MyoD对rDNA转录调控作用来促进横纹肌肉瘤细胞中rRNA合成,提示PHB2对核仁结构与功能的调节作用是其参与维持横纹肌肉瘤细胞存活、增殖及低分化的分子机制之一。在肝细胞癌细胞与正常肝细胞的对比研究中,我们亦发现PHB2特异地定位于肝细胞癌细胞而非正常肝细胞的核仁中,且具有促进肿瘤细胞而非正常细胞增殖以及能量代谢的作用,参与调控肿瘤细胞而非正常细胞的核仁功能。本研究提供了PHB2参与肿瘤发生发展过程的新证据并提出其发挥作用的新机制。