前言:耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistance S.aureus,MRSA)简称金葡菌,是临床常见的致病菌,可以引起多种感染性疾病。糖肽类抗生素万古霉素是临床治疗MRSA感染最常用的抗生素,也被认为是控制严重MRSA感染的最后一道防线。然而,随着万古霉素的大量使用,临床上万古霉素低敏感性金葡菌的检出率不断提高,其中万古霉素中介耐药的金葡菌(vancomycin-intermediate S.aureus,VISA)和异质性万古霉素中介耐药的金葡菌(heterogeneous VISA,hVISA)最为多见。普遍的观点认为VISA/hVISA是万古霉素敏感性金葡菌(vancomycin-sensitive Stahylococcus aureus,VSSA)或其部分子菌株在万古霉素的压力选择作用下产生的适应性耐药。VISA会发生细胞壁厚度、溶血、自溶、生物膜形成等方面的表型改变,但VISA在蛋白层面的耐药特征解析尚不充分。抗生素仍是目前治疗细菌感染性疾病最有效的药物,然而,在抗生素的压力选择作用下越来越多的细菌出现了多重耐药性,因此,寻求新的控制感染的方法变得更加迫切。目前,尽管对万古霉素完全耐药的金葡菌仍属罕见,但低水平万古霉素耐药的金葡菌hVISA和VISA的检出率仍然较高。免疫系统是机体对抗感染的重要武器。固有免疫系统能够快速识别并清除进入体内的病原体,是人体防御感染的第一道防线。巨噬细胞是机体的固有免疫细胞,能够吞噬和清除进入细胞内的病原体,并分泌多种生物活性物质,在机体的免疫防御中发挥重要作用。自噬是一种依赖溶酶体对细胞内的蛋白和细胞器进行降解的分解代谢过程,不仅在细胞应激过程中发挥有效的再循环作用,在抵御胞内菌感染过程中也起着重要作用。研究显示,巨噬细胞自噬在调节免疫和炎症反应中发挥重要作用,但一些胞内菌和病毒可以通过干扰细胞自噬体成熟来促使自身在宿主细胞内的存活。金葡菌最初被认为是一种胞外菌,但越来越多的研究表明其可以侵入宿主细胞,这可能是造成慢性持续性感染的重要原因。然而金葡菌在细胞内的命运尚不完全清楚。临床上VISA常常引起慢性持续性感染,这可能与VISA抵御宿主细胞对胞内菌的清除作用有关。文献报道VISA可以通过改变致病因子的表达逃避宿主细胞的免疫应答以利于持续感染。然而,VISA菌株是否能够通过调控宿主细胞的自噬过程逃避宿主细胞对其的清除目前尚无报道。因此,本研究选取临床分离的VSSA菌株11,模拟临床治疗增加万古霉素的用量,采用多步体外万古霉素诱导,得到万古霉素最低抑菌浓度(minimal inhibitoryconcentration,MIC)升高的VISA菌株11Y,用菌株11Y和11分别感染RAW264.7巨噬细胞来探究二者在细胞内存活、引起细胞自噬和炎症反应的情况以及他们调控RAW264.7细胞自噬和炎症反应的机制,并解析菌株11Y的耐药特征。研究方法:1.MTT实验检测菌株11Y和11分别感染RAW264.7巨噬细胞后30min、1h、2h、4h细胞的活力。2.BHI琼脂平板菌落计数法检测细胞内吞噬的菌株11Y和11的活力。3.透射电镜观察RAW264.7巨噬细胞内吞噬的菌株11Y和11周围的自噬代表性双层膜状结构。4.激光共聚焦显微镜检测菌株11Y和11感染后RAW264.7巨噬细胞内聚集成点状的LC3-Ⅱ。5.Real-time PCR检测菌株11Y和11感染后RAW264.7巨噬细胞炎症相关细胞因子IL-1β、IL-6、IFN-γ、TNF-α的mRNA表达。6.ELISA检测菌株11Y和11感染后RAW264.7巨噬细胞培养上清中上述炎症相关细胞因子的含量变化。7.荧光酶标仪检测菌株11Y和11感染后RAW264.7巨噬细胞内的ROS含量。8.Western Blot检测菌株11Y和11感染后RAW264.7巨噬细胞内NLRP3、mTOR/p-mTOR、LC3和SQSTM1的含量。9.用ROS抑制剂NAC清除菌株11Y和11感染后RAW264.7细胞产生的ROS,检测上述指标的变化。10.透射电镜观察并测定菌株11Y和11的细胞壁厚度。11.血琼脂平板测定菌株11Y和11的δ-溶血活性。12.可见光分光光度计测定菌株11Y和11的菌液吸光度值,判定自溶活性。13.结晶紫染色法检测菌株11Y和11的生物膜形成能力。14.串联质谱标签(TMT)标记菌株11Y和11的总蛋白,LC-MS/MS串联质谱分析差异表达蛋白。结果:1.菌株11Y和11感染RAW264.7巨噬细胞后均能够引起细胞发生自噬和炎症反应。(1)透射电镜结果显示11Y和11在感染RAW264.7细胞后4h,二者在细胞内的单个菌体周围均有自噬代表性的双层膜状结构,然而在包裹多个菌体的囊泡周围仅可见部分双层膜状结构或者无双层膜状结构,说明11Y和11感染RAW264.7细胞后均能够引起细胞自噬,随着二者在细胞内的分裂繁殖,细胞自噬受到抑制。(2)激光共聚焦显微镜结果显示11Y和11在感染RAW264.7细胞后的30min、1h、2h、4h,细胞内均能观察到聚集成点状的LC3-Ⅱ,说明二者感染RAW264.7细胞后均能够引起细胞发生自噬。(3)Real-time PCR结果显示11Y和11感染RAW264.7细胞后30min、1h、2h、4h,细胞IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表达量均显著升高,其升高程度与感染时间呈正相关,11Y与11感染组之间无显著性差异,而IFN-γ的表达量无显著变化。ELISA结果显示上述炎症相关细胞因子的蛋白表达水平与Real-time PCR结果基本一致。说明11Y和11感染RAW264.7细胞后均能够引起炎症反应,二者引起的炎症反应程度无显著差别。2.菌株11Y和11通过ROS/NLRP3/mTOR通路调控RAW264.7细胞自噬。(1)Western Blot结果显示11Y和11感染RAW264.7细胞后30min、1h、2h、4h,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ的表达均升高,11Y感染后各个时间点细胞LC3-Ⅱ的表达量均比11感染组高。菌株11Y感染细胞后30min,SQSTM1的表达先降低,随后升高至与对照组相当的水平,而菌株11感染细胞后各个时间点SQSTM1的表达量均降低。说明菌株11感染引起RAW264.7细胞发生自噬的自噬流通畅,而11Y感染引起的细胞自噬上游反应正常,下游自噬小体与溶酶体融合障碍。(2)菌株11Y和11均能引起RAW264.7细胞内NLRP3、p-mTOR含量升高,11Y感染后NLRP3、p-mTOR升高更多。荧光酶标仪检测结果显示11Y和11均能够引起RAW264.7细胞内ROS含量升高,二者感染后30min、1h、2h、4h细胞内的ROS含量无显著差别。说明11Y和11均可能通过ROS/NLRP3/mTOR通路调控RAW264.7细胞自噬。(3)菌株11Y和11感染NAC预处理24h的RAW264.7细胞后1h,细胞的NLRP3、p-mTOR、SQSTM1蛋白表达较NAC未处理组显著降低,LC3-Ⅱ蛋白表达较NAC未处理组显著升高,菌株11感染组上述指标变化更显著,进一步证实了菌株11Y和11均通过ROS/NLRP3/mTOR通路调控RAW264.7细胞自噬。3.菌株11Y在RAW264.7细胞内的存活能力增强,NAC对感染菌株11的细胞保护作用强,对感染11Y的细胞保护作用较弱。(1)BHI琼脂平板菌落计数结果显示菌株11Y和11在以感染复数MOI=25感染RAW264.7细胞后,在感染后30min、1h、2h、4h菌株11Y在细胞内的存活数量均比菌株11高10倍,说明11Y在RAW264.7细胞内的存活能力更强。NAC预处理24h的RAW264.7细胞几乎可以清除掉全部细胞内存活的菌株11,而只能清除掉部分细胞内存活的11Y,其数量比NAC未处理组下降了10倍,说明NAC对感染菌株11的细胞保护作用更强。(2)Real-time PCR结果显示,NAC预处理后11Y和11感染的RAW264.7细胞在30min、1h、2h、4h炎症相关细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表达均显著降低,11感染组比11Y感染组上述细胞因子表达量下降更多。ELISA结果显示上述炎症相关细胞因子的蛋白表达水平与Real-time PCR结果基本一致。说明NAC可以显著降低11Y和11感染RAW264.7细胞引起的炎症反应,进一步印证了NAC对感染菌株11的细胞保护作用更强。4.菌株11Y与11相比,11Y耐药相关表型和蛋白质表达均存在差异。(1)透射电镜结果显示11Y的细胞壁明显增厚;δ-溶血实验结果显示11Y与菌株RN4420交界面无溶血增强区出现,δ-溶血活性消失;自溶实验结果显示不同检测时间点11Y的吸光度值均显著高于11,自溶活性下降;生物膜形成实验结果显示11Y的生物膜形成减少,说明VISA菌株11Y与VSSA菌株11耐药相关表型存在差异,致病性降低。(2)TMT LC-MS/MS蛋白质组串联分析结果显示菌株11Y与耐药相关的结构蛋白和功能蛋白表达升高。11Y中表达量高于2.0倍的蛋白质共128个,低于0.5倍的蛋白质共21个。京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)聚类分析结果显示,这些差异表达的蛋白质主要分布在碳代谢、RNA降解、三羧酸循环、RNA合成、核糖体、嘧啶代谢、硫转运系统、肽聚糖合成、赖氨酸代谢、金葡菌感染和ABC转运等途径。说明11Y与11相比,耐药相关蛋白质表达存在差异,这些差异表达的蛋白质存在于细菌代谢和感染的多个途径。结论:1.菌株11Y和11感染RAW264.7巨噬细胞后均能够引起自噬和炎症反应,11Y引起的自噬严重不足,二者引起的炎症反应无显著差异。2.菌株11Y和11通过ROS/NLRP3/mTOR通路调控RAW264.7巨噬细胞自噬。3.菌株11Y和11的耐药相关表型和蛋白质表达存在显著差异。