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[目 的]1.制备Annexin V靶向微泡,评价其理化性质。2.Annexin V靶向微泡体外特异性识别微波消融诱导的凋亡CAL-62细胞。3.Annexin V靶向微泡体外特异性识别微波消融诱导的凋亡甲状腺肿瘤组织。[方 法]1.将DPPC,MPEG200,DPPA,DSPE-PEG2000按一定摩尔比充分混悬后分装于3ml西林瓶中,按特定冻干工艺程序冷冻干燥后,加入溶酶液,全氟丙烷(C3F8)置换其内空气,用机械振荡仪充分振荡后得普通微泡(MBs)。将DSPE-PEG2000替换为DSPE-PEG200-Biotin按相同方法制备得生物素化微泡。通过生物素—亲和素系统实现微泡与抗体偶联,将上述制备好的普通微泡与生物素化微泡离心洗涤后,依次加入链霉亲和素、生物素化Annexin V、FITC标记的二抗,避光冰上孵育后离心洗涤得Annexin V微泡(AVMBs)。在普通光学显微镜及荧光显微镜下分别观察MBs及AVMBs形态大小。粒径分析仪、Malvern表面电位仪测AVMBs粒径分布范围及Zeta电位。2.培养人甲状腺未分化癌CAL-62细胞,微波消融诱导其发生细胞凋亡,并通过流式细胞术及TUNEL检测法加以验证。选取生长情况相似的细胞,分组设计进行体外寻靶探究。A组:凋亡细胞+MBs,B组:正常细胞+AVMBs,C组:凋亡细胞+AVMBs。三组细胞经DiI染色后与微泡充分孵育结合,通过荧光显微镜检测其靶向性。使用图像分析软件IPP进行离线分析及采用SPSS软件包对与细胞结合的微泡进行统计学分析。3.建立人甲状腺未分化癌CAL-62裸鼠模型,微波消融诱导瘤体凋亡;流式细胞术及TUNEL检测法进行验证。设计实验,分组进行体外寻靶探究,a组:凋亡组织+MBs,b组:凋亡组织抗体预饱和+AVMBs,c组:凋亡组织+AVMBs。待组织与微泡充分孵育后荧光显微镜检测靶向性,使用图像分析软件IPP进行离线分析及采用SPSS软件包对与组织结合的微泡进行统计学分析。[结 果]1.成功制备普通微泡及Annexin V微泡。光学显微镜下:MBs与AVMBs均呈圆形,分布均匀、大小一致、形态稳定;荧光显微镜下:MBs不显像;而AVMBs大小一致,分布均匀的带绿色荧光的花环状结构。Annexin V靶向微泡的平均粒径(0.78±0.06)μm,Zeta 电位(-22.7±1.8)mV。2.微波消融CAL-62细胞后,经流式技术及TUNEL检测证实发生凋亡;镜下见,C组细胞表面可见大量发绿色荧光的AVMBs,而A、B组细胞表面基本没有微泡稳定聚集。经SPSS22.0统计分析,A-C组、B-C组分别进行U检验,P值均<0.05,差异有统计学意义。说明AVMBs可于体外靶向稳定结合凋亡CAL-62 细胞。3.成功建立人甲状腺未分化癌裸鼠模型,微波消融诱导瘤体凋亡,通过流式及TUNEL检测加以验证。c组,凋亡肿瘤组织上见稳定结合的靶向微泡,而a、b组仅极少数视野见个别微泡粘附。经IPP图像分析与SPSS22.0统计得出a-c组、b-c组Wilcoxon秩和检验P值均<0.05,差异有统计学意义。说明AVMBs可于体外稳定、有效地标记凋亡CAL-62细胞。[结 论]1.制备出大小一致、分布均匀、稳定性好的纳米级超声微泡;生物素-亲和素法制备Annexin V靶向超声微泡,为靶向识别凋亡细胞等后续研究提供显影剂。2.Annexin V微泡可在体外稳定、高效地识别凋亡CAL-62细胞。3.AnnexinV靶向微泡体外识别凋亡的实体肿瘤组织,为低能级微波消融致肿瘤凋亡状态提供分子影像检测方法。