【摘 要】
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目的H2AX是一种新型肿瘤抑癌蛋白,H2AX（Ser139）位点磷酸化（γH2AX）,在肿瘤细胞凋亡过程中发挥重要调控作用。肿瘤细胞上皮间质转化是肿瘤细胞恶性和转移的关键启动环节。H2AX是否
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目的H2AX是一种新型肿瘤抑癌蛋白,H2AX（Ser139）位点磷酸化（γH2AX）,在肿瘤细胞凋亡过程中发挥重要调控作用。肿瘤细胞上皮间质转化是肿瘤细胞恶性和转移的关键启动环节。H2AX是否调节肿瘤EMT和转移作用少见报道。本研究目的旨在探求H2AX是否参与调控肺癌细胞EMT和转移,以及H2AX调控EMT和转移的分子机制?方法以非小细胞肺癌A549细胞为研究对象,将实验设为两组:组一为A549（KD-H2AX,基因沉默）和A549（CTR,对照）;组二为A549-vector（转染空载体）,A549（H2AX-wt）（转染野生型H2AX）和A549（H2AX-139m）（转染Ser139磷酸化位点突变型H2AX）过表达稳定株细胞?使用5%血清刺激以上两组细胞,用划痕实验方法观察细胞的迁移能力;用Transwell实验方法检测两组细胞的迁移与侵袭作用;提取两组细胞的总蛋白,用蛋白免疫印迹实验方法（western blot）检测EMT的标志蛋白（E-Cadherin,Vimentin）水平;提取总RNA,RT-PCR检测两组细胞的E-Cadherin,Vimentin以及转录因子Zeb1/2,Slug,Snail,SIP1,Twist的mRNA水平?为了进一步研究H2AX磷酸化调控EMT转移的分子机制,同样的方法培养两组细胞。提取总RNA,RT-PCR分别检测两组肺癌细胞中血管内皮生长因子受体（VEGFR-1,VEGFR-2,VEGFR-3）mRNA的表达水平;提取总蛋白,western blot检测VEGFR-2蛋白表达;培养基因敲除(H2AX+/+和H2AX-/-)细胞,提取总蛋白western blot检测VEGFR-2表达。利用Lipofectamin 2000对A549细胞进行VEGFR-2siRNA转染,Transwell方法检测VEGFR-2敲低后对肺癌细胞迁移与侵袭能力的影响?每次实验独立重复3次,采用SPSS22.0软件分析?结果H2AX基因沉默促进肺癌细胞上皮间质转化;肺癌EMT与H2AX磷酸化相关;γH2AX抑制肺癌细胞EMT作用;γH2AX抑制VEGFR-2基因表达;基因沉默VEGFR-2抑制A549细胞EMT作用?结论磷酸化H2AX（γH2AX）通过下调VEGFR-2进而抑制肺癌A549细胞EMT作用?
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