目的:药物成瘾是一种以失去控制能力、强迫性用药行为为主要特征的慢性复发性脑疾病,形成机制尚不明确。在我国阿片类药物成瘾比较常见,且产生了巨大的危害。成瘾药物作用于脑内奖赏回路,产生强烈的奖赏效应,使吸毒者体验到强烈的欣快感,同时,使脑内相关神经环路发生长期神经可塑性改变,形成奖赏记忆,致使对药物产生强烈的心理渴求(精神依赖)。脱毒后,心理渴求依然存在且随着时间的推移越来越强烈,当吸毒者再次接触到复发诱发因素(先前的吸毒环境、药物或应激)时,极易触发心理渴求,诱发复吸,复吸是目前国内外戒毒治疗的难点。研究表明,已经巩固的奖赏记忆被唤起后,将经历一段不稳定的再巩固阶段,此过程极易药物或行为方法干扰,药物奖赏记忆被减弱或消除,从而达到消除心理渴求预防复吸的效果,目前,其具体机制还有待进一步确定。c-kit受体分布于中枢神经系统皮层、海马、伏隔核、杏仁核、以及低位脑干和小脑等部分脑区,是Ⅲ型酪氨酸激酶受体蛋白家族成员之一,SCF是c-kit受体的配体,属于最早的造血干细胞因子。研究表明,SCF/c-kit信号通路对正常神经功能维持和神经损伤修复的神经可塑性中起着重要作用。SCF与c-kit结合后被磷酸化活化,继而激活下游多种信号转导通路,包括PI3K/Akt、Ras/ERK、PLC-γ/PKC等信号通路,PLC-γ/PKC通路激活细胞内效应蛋白,PI3K/AKT活性与细胞的蛋白合成密切相关,Ras/ERK的激活启动基因表达与调控。本课题组及其他实验室前期研究发现,伏隔核和杏仁核PI3K/AKT/mTOR、Ras/ERK、PLC-γ/PKC 等信号通路在药物奖赏效应和记忆中起着各不相 同的重要作用,而且可以通过抑制以上任一信号分子通路干扰记忆再巩固过程,使稳固的吗啡、可卡因、酒精奖赏记忆消失,从而达到了消除心理渴求预防复吸的效果。c-kit是众多下游信号转导分子的共同激活受体,且在药物成瘾相关神经环路表达,而SCF/c-kit信号通路在药物成瘾中的作用未见报道。因此,我们推测SCF/c-kit信号通路很可能在药物成瘾过程中发挥着重要作用,c-kit可能作为用于干预药物奖赏记忆再巩固的防止复吸的重要分子基础。本论文将采用分子结合行为的方法,确定SCF/c-kit信号通路在阿片类药物依赖心理渴求中的作用及机制,从而证实c-kit受体分子成为阿片药物戒毒新的分子基础的可行性,以及其抑制剂伊马替尼类化合物能否成为潜在的新型药物成瘾治疗药物。方法:本课题采用两部分实验证实SCF/c-kit信号通路在阿片类药物成瘾形成和记忆再巩固中的作用及机制,包括:第一部分:SCF/c-kit信号通路在阿片类药物成瘾形成中的作用及分子机制1)免疫组化检测急性吗啡给药后c-kit受体在中枢神经系统的激活情况;2)Western blot检测c-kit抑制剂甲磺酸伊马替尼对吗啡激活中枢成瘾相关脑区的抑制作用;3)免疫荧光双标共定位检测急性吗啡激活c-kit在伏隔核神经细胞的分布;4)免疫组化检测吗啡激活c-kit受体下游Akt、ERK、PKC在伏隔核的活性变化;5)免疫荧光双标共定位检测急性吗啡激活c-kit受体后,c-kit受体活化和下游Akt、ERK、PKC在伏隔核神经细胞的共分布情况;6)采用药物成瘾大鼠条件位置偏爱和敏化模型,检测c-kit药物成瘾形成中的作用;7)为了证实SCF/c-kit信号通路上述作用是阿片药物特异性的,Western blot检测自然奖赏物质蔗糖对c-kit激活的情况;第二部分:SCF/c-kit信号通路在阿片类药物成瘾记忆再巩固中的作用及分子机制1)Western blot结合行为学方法检测c-kit受体在阿片药物奖赏记忆再激活中的活化情况;2)系统给予c-kit受体抑制剂甲磺酸伊马替尼,观察其对阿片类药物奖赏记忆再巩固的影响,确定伊马替尼类化合物作为戒毒药物潜在可行性。3)为了进一步验证伊马替尼类化合物系统给药对干扰奖赏记忆并非抑制其运动能力导致的,同等剂量下检测其对大鼠自发活动的影响;4)最后通过心率和血压监测系统给药的主要心血管副作用。结果:通过分子结合行为学实验,SCF/c-kit信号通路在阿片类药物成瘾中的作用及机制主要结果如下:第一部分:SCF/c-kit信号通路在阿片类药物成瘾形成中的作用及分子机制1)免疫组化结果显示,急性吗啡给药后c-kit受体活化在中枢神经系统成瘾相关环路中脑区的定位情况是只有伏隔核出现活性增强,统计学差异具有显著性;前额皮层、海马、杏仁核以及中脑腹侧被盖区活性变化统计学差异没有显著性;摄食相关脑区下丘脑弓状核活性变化统计学差异同样没有显著性;2)吗啡给药前腹腔注射c-kit抑制剂甲磺酸伊马替尼后,Western blot定量检测显示,甲磺酸伊马替尼给药后由吗啡激发的伏隔核Akt活性较吗啡组明显降低,统计学差异具有显著性,其他脑区未见明显变化;3)免疫荧光双标共定位发现,急性吗啡激活c-kit定位在伏隔核core和shell两个亚区的神经元细胞内;4)免疫组化实验显示:吗啡激活c-kit受体后,下游Akt、ERK、PKC活化在伏隔核core和shell亚区出现不同程度的活化,统计学差异具有显著性的主要为:Akt活化脑区主要出现在伏隔核core,ERK在伏隔核core和shell亚区均出现活化,PKCzeta活化主要分布于伏隔核core;5)免疫荧光双标检测急性吗啡激活c-kit受体后与下游活化信号分子对应共定位于同一神经细胞内,且c-kit受体活性与PI3K/Akt/mTOR、Ras/ERK、PLC-γ/PKC信号通路激活情况具有一致性;6)大鼠条件位置偏爱实验显示,大鼠给予甲磺酸伊马替尼后,条件位置偏爱不能形成;同样给予甲磺酸伊马替尼后的大鼠,敏化不能形成;7)为了证实SCF/c-kit信号通路上述结果是阿片药物特异性作用,Western blot检测蔗糖对c-kit激活的情况主要是,成瘾相关脑区活化变化统计学差异均没有显著性。第二部分:SCF/c-kit信号通路在阿片类药物成瘾记忆再巩固中的作用及分子机制1)Western blot结合行为学方法检测c-kit受体在阿片药物奖赏记忆再激活后活性较对照组增高,统计学差异不具有显著性;2)系统给予c-kit受体抑制剂甲磺酸伊马替尼,同样发现已经形成的条件位置偏爱消失;3)同等剂量下伊马替尼类化合物化合物系统给药对大鼠自发活动的影响不明显;4)心率和血压监测结果显示,甲磺酸伊马替尼系统给药对血压影响不明显。结论:通过以上实验,本课题得出只要结论如下:1)SCF/c-kit信号通路在阿片类药物成瘾形成中起着重要作用,急性吗啡给药分别激活成瘾药物奖赏效应和记忆关键脑区伏隔核神经元的c-kit受体,进一步活化下游PI3K/Akt/mTOR、Ras/ERK、PLC-γ/PKC信号通路,通过激活效应分子、增加蛋白合成、启动基因表达与调控多方面使伏隔核core和shell发生不可逆性神经可塑性变化,从而使药物奖赏记忆形成,持久终生不可消除。2)基于药物记忆再巩固研究发现,第二部分实验验证了 SCF/c-kit信号通路在药物奖赏记忆中的重要作用,采用其抑制剂伊马替尼类化合物可是此记忆永久消除,并进一步验证其有效性和心血管副作用,以上这些记过显示,SCF/c-kit受体可作为药物奖赏记忆干预的新的分子基础,伊马替尼类化合物具有潜在的药物成瘾治疗的应用前景。总之,本实验研究结果进一步拓展了药物成瘾神经生物学机制,并为阿片类药物成瘾治疗提供了新的分子基础。