研究背景：IgA肾病(IgA nephropathy, IgAN)又称Berger病,1968年由Berger和Hinglais使用免疫荧光技术对持续镜下血尿的患者进行肾活检时第一次描述,目前IgA肾病已被世界公认为最常见的原发性肾小球疾病。IgA肾病主要临床表现为血尿、蛋白尿和肾功能进行性损害,超过40%的患者在20年内进展为终末期肾病。本病确诊需要肾活检病理检查,特征性病理表现为肾小球系膜区沉积IgAl和低糖基化IgAl聚合体形成的免疫复合物,可伴有IgG和/或IgM及补体成分沉积。国内外学者对IgA肾病的发病机制进行了较多研究,有学者认为IgA肾病发病的病理生理过程经历四个阶段：第一步为分泌IgAl的细胞亚群产生低糖基化IgAl增加,第二步为产生针对重链可变区半乳糖基缺陷IgAl的抗多聚糖特异性抗体；第三步为产生的特异性抗体与低糖基化IgAl形成循环免疫复合物；第四步为循环免疫复合物沉积于肾小球系膜,活化肾小球系膜细胞及补体系统,介导肾小球损伤。由此可见,低糖基化IgAl是IgA肾病发病的始动因子。近年来,有研究证实IgA肾病发病与扁桃体粘膜免疫功能紊乱关系密切。IgA肾病患者腭扁桃体分泌IgAl和J链阳性IgA的淋巴细胞增多,产生的低糖基化IgAl与肾小球系膜区沉积的IgAl高度一致,提示肾小球系膜区沉积的低糖基化IgAl可能部分来源于扁桃体。我们前期研究发现IgA肾病患者行腭扁桃体摘除术后72小时,血清IgA和IgAl水平显著增高,尿检红细胞和蛋白均增高,可能由于IgA肾病患者在感染、牵拉、挤压腭扁桃体等刺激情况下,腭扁桃体分泌IgAl细胞产生大量IgAl,进入循环沉积于肾小球导致尿检恶化。长期随访观察显示行腭扁桃体切除术患者尿检改善,血尿、蛋白尿得到缓解,血清IgA及IgAl水平显著降低。此外,一些临床对照研究也证实IgA肾病患者行腭扁桃体摘除术后尿检正常率、肾功能稳定率和肾脏存活率均高于未切除组,循环中IgA水平明显下降。MicroRNA (miRNA)是真核生物中一类具有内源性调控功能的非编码RNA,大小19-23bp,通过种子序列(seed sequence)与目标mRNA的3’-UTR区互补结合,降解目标mRNA或抑制其蛋白翻译,对目标基因进行转录后调控。目前研究表明miRNA在免疫细胞发育、活化、炎症产生及免疫耐受过程中起重要作用。B细胞发育过程需要miRNAs调控,敲除Dicer酶的小鼠缺乏B细胞,Dicer酶是niRNA生物合成过程中的关键酶。深度测序技术(deep sequencing)证实miR-181家族选择性表达于早期和过渡期B细胞阶段,miR-181a抑制促凋亡基因BIM,减少B细胞凋亡；同时发现niR-146a,miR-155和miR-34a选择性表达于B细胞,调节B细胞分化。这些miRNA参与生发中心反应和记忆B细胞应答,其表达下调能够改变B细胞稳态,破坏免疫耐受,促进自身抗体的产生。IgA肾病是一种自身免疫性疾病,IgA肾病患者腭扁桃体粘膜免疫处于激活状态,我们推测miRNA参与调控粘膜异常免疫反应。TLR4是模式识别受体,属于Toll样受体家族(TLRs),表达于多种免疫细胞表面,可识别革兰阴性细菌脂多糖(LPS)、热休克蛋白、纤维蛋白原等。TLR4与配体结合后,活化干扰素调节因子IRF-3/IRF-7和NF-κB转录因子,引起细胞因子、趋化因子、细胞表面粘附分子和共刺激分子产生增加,同时促进固有免疫和适应性免疫应答及炎症反应。多个研究发现对IgA肾病患者外周血淋巴细胞加以LPS刺激,检测p-1,3-半乳糖转移酶酶(C1GALT)和COSMC活性降低,我们前期研究也发现LPS刺激腭扁桃体单个核细胞后,促进Th0朝向Thl分化,细胞培养上清液IgAl含量明显增高,提示LPS刺激促进腭扁桃体单个核细胞产生IgA1。LPS/TLR4信号通路活化已被证实对B细胞发育和分化成熟过程起辅助刺激作用。由此我们推测,IgA肾病患者腭扁桃体可能存在TLR4高表达,通过调控B细胞的分化和成熟,促进低糖基化IgAl产生。本实验研究首次采用芯片技术对IgA肾病患者腭扁桃体miRNA表达谱进行分析,鉴定与非肾病扁桃体炎患者miRNA的差异表达,发现IgA肾病患者腭扁桃体单个核细胞miR-630表达明显降低,与IgAl表达及IgAl低糖基化相关。使用Targetscan、miRanda、PICTA5三个软件对miRNA-630进行靶基因预测,DAVID数据库对候选靶基因进行GO (Gene Ontology)功能分析,提示TLR4是rniR-630的预测靶基因,miR-630可能结合于TLR43’-UTR区降解TLR4mRNA或抑制其蛋白翻译。采用miR-630mimic转染IgA肾病患者腭扁桃体单个核细胞,模拟细胞miR-630表达上调,观察miR-630对TLR4表达、IgAl含量及其糖基化水平的作用,为IgA肾病发病的粘膜免疫机制提供新的理论依据。第一章microRNA-630在IgA肾病患者腭扁桃体单个核细胞的表达及与IgAl低糖基化的相关性研究目的：探索IgA肾病与非肾病扁桃体炎患者腭扁桃体组织差异表达的microRNA (miRNA),检测腭扁桃体单个核细胞miR-630的表达,IgAl的分泌情况及其铰链区糖基化水平,分析miR-630与IgAl及其糖基化水平之间的关系,预测miR-630候选靶基因。方法：收集经肾活检病理检查确诊为IgA肾病患者的腭扁桃体组织27例作为实验组(IgAN组),非肾病扁桃体炎患者腭扁桃体20例作为对照组(CT组),每组患者随机选取2例,通过Agilengt Human miRNA microarrays V19检测IgA肾病与非肾病扁桃体炎患者腭扁桃体miRNA表达谱,分析差异表达的]miRNA,并采用qRT-PCR对部分rniRNA进行验证。分离培养腭扁桃体单个核细胞,通过qRT-PCR检测腭扁桃体单个核细胞miR-630表达,ELISA检测细胞培养上清液IgAl含量,IgAl-蚕豆凝集素(VVL)结合实验检测IgAl与VVL结合力,反映IgAl铰链区糖基化水平。通过Pearson相关性分析及直线回归对腭扁桃体单个核细胞miR-630表达与IgAl含量及其低糖基化水平进行相关性分析。选取Targetscan、miRanda、 PICTA5三个常用算法对miRNA-630进行靶基因预测,为减少假阳性,记录3个软件的交集为miRNA-630的候选靶基因,利用DAVID数据库对候选靶基因进行GO功能(Gene Ontology)生物过程富集(GO_BP)和信号通路分析(KEGG_PATHWAY),选择与免疫系统关系密切的靶基因进行下一步实验。结果：1、miRNA基因芯片鉴定结果显示IgA肾病患者与非肾病扁桃体炎患者相比,腭扁桃体差异表达]miRNA共29个,其中表达上调miRNA7个,表达下调]miRNA22个,改变倍数>2倍。qRT-PCR验证结果显示IgA肾病患者腭扁桃体miR-630, miR-513b, miR-135a-3p, miR-642-3p表达明显低于与非肾病扁桃体炎患者,结果具有统计学意义(P<0.01), miR-148-3p, miR-155-5p表达无明显差异,验证结果与芯片检测结果一致。2、IgA肾病患者腭扁桃体单个核细胞miR-630表达显著低于非肾病扁桃体炎患者,结果具有统计学意义(P<0.01)。3、IgA肾病患者腭扁桃体单个核细胞培养上清液IgAl含量较非肾病扁桃体炎患者明显增加(p<0.01),IgAl与蚕豆凝集素结合力(IgAl-VVL-binding OD值)明显增高(p<0.01),间接说明IgAl糖基化水平降低。4、Person相关性分析及直线回归显示IgA肾病患者腭扁桃体单个核细胞miR-630表达与IgAl含量及IgAl与VVL的结合力(IgAl-VVL-binding OD值,OD值增大,间接说明IgAl糖基化水平降低)呈负相关,相关系数分别为r=-0.733,p=0.006和r=-0.697,p=0.011。5、Targetscan、miRanda、PICTA5三种软件对miR-630进行靶基因预测,并通过GO功能分析提示miR-630的候选靶基因与免疫系统相关。TLR4是miR-630的预测靶基因,TLR4的3’-UTR区有6个碱基对与miR-630的种子序列互补配对。结论：IgA肾病患者与非肾病扁桃体炎患者腭扁桃体miRNA存在差异表达,IgA肾病患者腭扁桃体单个核细胞miR-630表达较非肾病扁桃体炎患者明显降低,细胞培养上清液IgAl分泌增加,IgAl与蚕豆凝集素结合力(IgA1-VVL-binding OD值)增大,反应IgAl糖基化水平降低,且miR-630表达与IgAl含量及IgA1-VVL-bindingOD值负相关,提示IgA肾病患者腭扁桃miR-630表达下调可能与IgA肾病低糖基化IgAl产生相关。miR-630预测靶基因与免疫系统相关,TLR4是miR-630的预测靶基因,miR-630可能结合于TLR43’-UTR区降解TLR4mRNA或抑制其蛋白翻译。第二章TLR4在腭扁桃体的表达及miR-630对IgA肾病腭扁桃体单个核细胞TLR4及IgAl低糖基化表达的作用目的：检测TLR4在IgA肾病与非肾病扁桃体炎患者腭扁桃体的表达,分析TLR4与miR-630、IgAl及其糖基化水平之间的关系。采用miR-630mimic转染IgA肾病患者腭扁桃体单个核细胞,模拟细胞miR-630表达上调,观察miR-630对TLR4表达、IgAl含量及其糖基化水平的影响。方法：免疫组织化学染色法检测腭扁桃体TLR4表达水平,使用图像半定量分析法对结果进行统计；密度梯度离心法分离腭扁桃体单个核细胞,采用qRT-PCR和Western blot技术分别检测TLR4mRNA和蛋白表达。通过Pearson相关性分析及直线回归对腭扁桃体单个核细胞TLR4表达与miR-630表达、IgAl水平及其低糖基化水平进行相关性分析。IgA肾病腭扁桃体单个核细胞转染miR-630mimic,细胞培养72小时后,通过免疫荧光显微镜观察转染细胞形态和转染效率,qRT-PCR、Western blot技术分别检测转染后TLR4mRNA和蛋白表达,ELISA检测转染后细胞培养上清液IgAl含量,IgAl-蚕豆凝集素(VVL)结合实验检测IgAl与VVL结合力,反映IgAl铰链区糖基化水平。结果：1、免疫组化结果显示IgA肾病与非肾病扁桃体炎患者腭扁桃体均表达TLR4,主要分布于扁桃体淋巴小结生发中心,IgA组TLR4表达明显增加(p<0.05)。2、qRT-PCR及Western blot结果显示IgA肾病患者腭扁桃体单个核细胞TLR4mRNA和蛋白表达较非肾病扁桃体炎患者明显增加,结果具有统计学意义(p<0.05)。3、Person相关性分析及直线回归显示IgA肾病患者腭扁桃体单个核细胞TLR4表达与miR-630表达呈负相关,r=-0.818,p=0.001；TLR4表达与IgAl含量及IgAl与VVL的结合力(IgA1-VVL-bindingOD值,OD值增大,间接说明IgA1糖基化水平降低)呈正相关,相关系数分别为r=0.880,p=0.000和r=0.789,p=0.002。4、IgA肾病患者腭扁桃体单个核细胞转染miR-630mimic72小时后,与阴性对照及空白对照组相比,细胞形态及细胞数目无明显改变,转染效率约70%。qRT-PCR检测腭扁桃体单个核细胞转染miR-630mimic后,miR-630表达较空白对照组升高38.7倍,结果具有统计学意义(p<0.01),阴性对照组与空白对照组miR-630表达无明显改变(p>0.05)。5、IgA肾病患者腭扁桃体单个核细胞转染miR-630mimic72小时后,TLR4mRNA和蛋白表达水平较空白对照组明显降低(p<0.01),阴性对照组与空白对照组TLR4表达无明显改变(p>0.05)。6、IgA肾病患者腭扁桃体单个核细胞转染miR-630mimic72小时后,细胞培养上清液IgAl含量较空白对照组明显降低(p<0.01),阴性对照组与空白对照组无明显差异；IgAl与蚕豆凝集素结合力(IgA1-VVL-binding OD值)较空白对照组降低(p<0.05),说明转染后IgAl铰链区半乳糖基化水平升高,阴性对照组与空白对照组无明显差异(p>0.05)。结论.IgA肾病患者腭扁桃体TLR4高表达,且TLR4表达与IgAl含量及IgA1-VVL-binding OD值(OD值增大,间接说明IgAl糖基化水平降低)正相关,提示TLR4与低糖基化IgAl产生相关。miR-630是TLR4的负性调节因子,miR-630可抑制TLR4表达,减少低糖基化IgAl产生。IgA肾病患者腭扁桃体miR-630表达下调可能参与腭扁桃体IgAl产生及其铰链区低糖基化,机制可能由于miR-630表达下调导致对TLR4的抑制作用降低有关。