目的:先天性脊柱侧凸（congenital scoliosis,CS）的患病率约为千分之一。CS主要表现为脊柱的三维畸形,同时在脊柱生长过程中会造成全身的不平衡,主要原因是先天性椎体发育异常。但CS的确切致病因素尚不清楚,以往的一些研究表明遗传和环境因素均参与CS的发生和发展。随着技术的更新,全外显子组测序（Whole Exome Sequencing,WES）为我们研究基因点突变、插入、缺失等突变以及单核苷酸变异提供了很好的手段。WES技术对样本数量和资本支出的要求较少,数据分析技术也逐渐完善,现在得到越来越广泛的应用。关于骨骼发育和相关疾病,斑马鱼近年来逐渐被用于实验。由于斑马鱼主要在水中活动,因此脊椎会持续承受压力。与小鼠等四肢动物相比,斑马鱼的脊椎承受的压力更接近人类,因此斑马鱼更适合研究脊柱畸形相关疾病。因此,本研究的目的是通过WES和斑马鱼模型动物研究探索CS可能的致病基因。方法:对于外显子组测序,我们选择了由6个trios组（由一个散发性先天性脊柱侧弯患者和两个健康的父母组成）（系列1）组成的发现集,我们在另外的2个trios组和6个配对组（包括一个患有散发性先天性脊柱侧弯的人和一个健康的父亲或者母亲）（系列2）。本研究共纳入8个先天性脊柱侧弯家系和6个来自中国的散发病例。有害性的注释主要有SIFT、Polyphen2＿HDIV、Polyphen2＿HVAR、LRT、Mutation Taster、Mutation Assessor、FATHMM、PROVEAN、VEST3、Meta SVM、Meta LR、M＿CAP、CADD、DANN、FATHMM＿MKL、Eigen、Geno Canyon、fit Cons、GERP、phylo P、phast Cons、Si Phy、REVEL、Re Ve。基因功能的注释主要通过Genecard（https://www.genecards.org/）、Ontology（GO）、KEGG数据库、OMIM数据库以及Enrichr（https://maayanlab.cloud/Enrichr/）进行注释。基因的组织特异性表达情况的注释主要是通过GTEx database（www.gtexportal.org）和Proteomics DB（www.proteomicsdb.org）。同时,通过检测Gene Paint（www.genepaint.org）以及Allen Spine Column（mousespinal.brain-map.org）databases查询发育中的脊柱骨骼中基因的表达模式。这些在线服务器提供14.5-d-postcoitum（dpc）小鼠胚胎、P4和P56小鼠脊髓组织的完整切片系列的显微照片,这些组织是用非放射性探针为ISH处理的。使用Chimera 1.15软件用于对基因的野生型（WT）和突变型（Mut）域进行建模,WT模板从SWISS-MODEL工具（https://swissmodel.expasy.org/）下载。筛选出候选基因之后进行Sanger测序验证。使用ELISA测定突变家系血浆当中相关蛋白的表达。构建突变质粒,导入HEK293细胞当中,并进行蛋白免疫印迹并使用q RT-PCR检测突变对成骨和成软骨相关基因m RNA表达的影响。为了进行吗啡啉（MO,Gene Tools）基因敲减,我们合成了反义吗啡啉片段。针对斑马鱼myom2a和myom2b基因的翻译起始点的MO1,以及针对MO1序列5-bp错配的对照5MISMO。所有吗啡啉都需要使用幼鱼培养基稀释,并且在一细胞期的斑马鱼受精卵时候进行微注,通过显微镜以及骨骼染色观察畸形改变。结果:总共纳入了六个家系,所有患者都是CS,并且没有其他综合征,其中有五个患者是半椎体,一个是阻滞椎。候选基因（MYOM2,NOTCH2,CTBP2,LILRB3,LILRA6,MYH14）的生物学功能注释结果显示,这些基因能够调控破骨细胞的发育,参与Notch通路,参与Wnt通路,肌球蛋白结构组织。有害分析结果显示:LILRB3:c.1701T＞A以及LILRB3:c.428G＞A都是无害的,而其余突变都有过数据预测是有害的。为了检查候选基因是否参与脊椎发育,通过查询,数据库里面并没有Lilra6的数据,ISH图片当中的14.5 dpc小鼠胚胎的矢状切片可以观察到Myom2以及Notch2在脊柱的中轴骨区域存在表达,而Ctbp2,Lilrb3,和Myh14并没有观察到表达,此外,Allen Spinal Column横断面4天龄幼鼠脊柱组织的ISH分析显示,这五个基因在脊髓软骨和脊髓周围的软组织都有一定程度的表达,其中Myh14表达最丰富,而Myom2次之。Sanger测序验证结果当中显示并不存在CTBP2:c.2929G＞A和MYH14:c.6107A＞C这两个突变,验证到MYOM2:c.3872G＞T以及MYOM2:c.3997T＞C这两个突变。经过进一步的生物信息学分析以及一代测序验证,我们排除了其中的五个（CTBP2、MYH14、NOTCH2、LILRB3和LILRA6）,因为它们要么不在脊柱中表达,要么在功能上不相关或者并不存在突变。最终我们确定了MYOM2:c.3872G＞T以及MYOM2:c.3997T＞C这两个突变。因此,首先对其氨基酸的保守性进一步分析,结果显示,1291位点较为保守,而1333位点不保守,未突变之前是F,突变之后是L,反而导致与动物位点氨基酸相同。ELISA结果表明,患者血浆当中MYOM2相比于父母是下降的,而且具有统计学意义,父母之间并没有差异。通过Western blotting检测MYOM2蛋白表达量的变化,结果显示MYOM2:c.3872G＞T或MYOM2:c.3997T＞C单个突变时对MYOM2蛋白表达影响比较低,而MYOM2:c.3872G＞T和MYOM2:c.3997T＞C双突变会导致MYOM2蛋白表达显著下降。q RT-PCR结果表明,MYOM2:c.3872G＞T和MYOM2:c.3997T＞C双突变会导致成骨细胞晚期成熟标志物SP7和OC m RNA表达降低,但会导致成软骨标志COL II和COL X表达升高。此外双突变也会导致IHH,SOX9,COL I,RUNX2的轻微增加。胚胎形态学观察发现,在2 ng myom2b-MO1注射组中观察到斑马鱼的严重发育缺陷,包括变形的头部、小眼睛、侧弯的脊柱和未消耗的卵黄囊,并且与WT组以及具有相同剂量的对照5MIS组相比,异常和死亡斑马鱼的总数要高得多。然而注射myom2a-MO1与WT组以及具有相同剂量的对照5MIS组相比,并没有差别。使用myom2b m RNA进行拯救实验,结果发现在斑马鱼myom2b m RNA与myom2b-MO1共同注射后,吗啡啉突变体的表型至少部分被挽救。骨骼染色发现myom2b-MO1组的下颌尺寸也显着减小,其特征是角软骨（ch）和Meckel软骨（Mk）之间的距离减小,然而注射myom2a-MO1与WT组以及具有相同剂量的对照5MIS组相比,并没有差别。结论:通过WES,细胞实验以及斑马鱼模型的构建,我们发现本研究中发现MYOM2联合错义突变与CS的发生是相关的,其中CS可以是常染色体隐性遗传致病,而且是由于MYOM2联合错义突变导致的（MYOM2:c.3872G＞T联合MYOM2:c.3997T＞C）。同时我们还发现MYOM2:c.3872G＞T联合MYOM2:c.3997T＞C可以导致部分成骨基因m RNA表达（特别是SP7和OC）下降,但是可以导致部分成软骨基因m RNA表达（特别是COL II和COL X）上升,这说明MYOM2联合错义突变能够影响成骨细胞的成熟以及分化过程。斑马鱼的研究中发现斑马鱼myom2a和myom2b基因与哺乳动物同源基因相比是高度保守的,早期斑马鱼发育当中,主要是以myom2b表达为主,斑马鱼myom2b基因的敲减会促进斑马鱼发生CS样脊柱畸形的改变。通过上述实验,我们发现先天性脊柱侧弯的发生可能与MYOM2突变有关,有关机制正在进一步研究中。