【摘 要】
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目的研究细胞周期蛋白20（Cdc20）和葡萄糖调节蛋白78（GRP78）相互作用的情况,确定Cdc20与GRP78在肝细胞癌（HCC）索拉非尼耐药中的作用及其作用机制,探讨Cdc20作为临床治疗索拉非尼耐药性HCC潜在靶点的可能性。方法1、应用渐增浓度索拉非尼筛选肝细胞癌细胞株Hep G2,获得索拉非尼耐药细胞株Hep G2-SR,倒置显微镜下观察细胞形态。给予Hep G2、Hep G2-SR细胞
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目的研究细胞周期蛋白20（Cdc20）和葡萄糖调节蛋白78（GRP78）相互作用的情况,确定Cdc20与GRP78在肝细胞癌（HCC）索拉非尼耐药中的作用及其作用机制,探讨Cdc20作为临床治疗索拉非尼耐药性HCC潜在靶点的可能性。方法1、应用渐增浓度索拉非尼筛选肝细胞癌细胞株Hep G2,获得索拉非尼耐药细胞株Hep G2-SR,倒置显微镜下观察细胞形态。给予Hep G2、Hep G2-SR细胞梯度浓度的索拉非尼,采用MTT、克隆形成实验检测细胞增殖能力,采用免疫印迹实验检测Hep G2、Hep G2-SR细胞中Cdc20、GRP78、DUSP6、p-ERK的表达。2、将索拉非尼耐药细胞Hep G2-SR分别以细胞数为100、1000、10000接种于BABL/C小鼠上肢背侧,对侧接种相同细胞数的Hep G2细胞作为对照,观察裸鼠成瘤能力。3、采用免疫共沉淀实验筛选与Cdc20相互作用的蛋白,并检测Cdc20与GRP78是否存在相互作用,采用免疫荧光实验检测Cdc20、GRP78蛋白定位。结果1、倒置显微镜下观察细胞形态,Hep G2细胞生长状态良好,Hep G2-SR细胞呈细长的梭形;MTT结果显示,与Hep G2细胞比较,Hep G2-SR细胞存活率明显升高;克隆形成实验结果显示,与Hep G2细胞比较,Hep G2-SR细胞克隆形成数明显增多;免疫印迹实验结果显示,与Hep G2细胞比较,Hep G2-SR细胞中Cdc20、GRP78、p-ERK表达明显升高,而DUSP6的表达低于对照组。2、观察裸鼠成瘤能力,与接种Hep G2细胞的裸鼠比较,Hep G2-SR细胞的裸鼠成瘤能力明显增高,且随着接种Hep G2-SR细胞数增多,成瘤瘤体体积越大。3、免疫共沉淀实验筛选结果显示GRP78可能是与Cdc20相互作用的蛋白,免疫共沉淀实验结果显示Cdc20与GRP78存在相互作用;免疫荧光实验结果显示Cdc20与GRP78存在共定位。结论Cdc20在索拉非尼耐药性HCC细胞中过度表达,通过与GRP78相互作用激活ERK导致HCC细胞索拉非尼耐药,因此Cdc20可能是索拉非尼耐药性HCC治疗的潜在靶点。
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