目的:毛乳头细胞(dermal papilla cells,DPCs)是一组位于毛囊基底部的真皮源性细胞,对毛囊的生长发育、周期调控以及维持毛发生长起着主导作用。毛乳头细胞结构或功能的异常是导致毛囊生长失衡的主要起始因素。毛乳头空间位置隐蔽,给毛乳头的分离培养带来了一定困难,但由于其重要的生理作用,人们对毛乳头细胞的研究一直没有间断过,并逐渐成为毛囊生长发育及周期调控的研究的热点。体外培养的毛乳头细胞在形态上类似成纤维细胞,但本质上却不同于成纤维细胞。在生长方式上,培养的毛乳头细胞最明显的特征是细胞融合前形成的多层化的细胞团块,即凝集性生长的特性。但毛乳头细胞的凝集性生长特性将随着细胞传代次数的增多而逐渐减弱,一般情况下,第7代以后的毛乳头细胞将失去凝集性生长的能力。凝集性生长是毛乳头细胞重要的生物学特性之一与毛乳头细胞的生物学功能密切相关。有研究证明,低传代毛乳头细胞的条件培养基能使高传代毛乳头细胞恢复凝集生长的现象,毛乳头细胞在低传代时许多细胞因子表达呈阳性随着传代次数的增多逐渐转为阴性。由此推测低传代的毛乳头细胞分泌或表达的某些生长因子的变化可能与毛乳头细胞凝集性生长的状态有关。已有研究证明,毛乳头细胞能分泌多种生长因子如血管内皮生长因子,肝细胞生长因子,转化生长因子-β,胰岛素样生长因子-Ⅰ等。但具体是何种生长因子,通过何种途径,起着何种作用还值得进一步研究。对毛乳头细胞的相关因子进行研究有助于了解毛乳头细胞在毛囊生长发育、周期调控和毛发生长过程中所起的作用,对毛发相关疾病的治疗及皮肤组织工程学的进展具有重要意义。本实验旨在通过对毛乳头细胞的分离培养方法进行改良,获得足够的毛乳头细胞;对体外不同传代培养的毛乳头细胞干细胞因子(SCF)及血管内皮生长因子(VEGF)的表达进行观察;并观察SCF及VEGF对体外培养的毛乳头细胞生长增殖的影响。方法:1毛乳头细胞的分离培养及一般生长特性观察。采用改良毛乳头细胞培养法[1],获得足够的细胞培养于10%的DMEM培养基中,置于37℃、饱和湿度、5%的CO2培养箱内常规传代培养。倒置相差显微镜观察细胞形态及生长状态。2α-平滑肌肌动蛋白染色、甲苯胺蓝染色、PAS染色鉴定毛乳头细胞。3应用免疫组化SP法及流式细胞仪(FCM)测不同传代次数的毛乳头细胞SCF及VEGF的表达变化情况。4采用MTT比色法绘制毛乳头细胞生长曲线用于观察SCF及VEGF对毛乳头细胞生长增殖的影响。5运用统计软件SPSS13.0对数据进行统计处理。结果:1在毛乳头的分离过程中我们采用改良毛乳头细胞培养法,不但节约了标本并且降低了劳动难度,成功的进行了毛乳头细胞的分离培养。分离的毛乳头细胞纯度高、贴壁迅速,并且培养的毛乳头细胞具有典型的生长特性:凝集性生长。凝集性生长的特性随着传代次数的增多逐渐减弱,7代以后完全消失。2所获得的细胞经免疫组化染色胞浆内表达α-平滑肌肌动蛋白;甲苯胺蓝染色呈异染性;PAS染色细胞胞浆为红色。3免疫组织化学法检测不同传代次数的毛乳头细胞SCF及VEGF的表达情况。SCF及VEGF主要表达于胞浆内,随着传代次数的增多,表达逐渐减弱。4流式细胞仪(FCM)测不同传代次数的毛乳头细胞SCF及VEGF的表达情况。生长因子的表达量用均道值来表示。对3代、6代,6代、9代的SCF及VEGF的均道值进行两两比较,统计结果分析具有显著性差异(P<0.05),随着细胞传代次数的增多生长因子的表达量不断减少。5 SCF组及VEGF组与对照组相比较,细胞生长曲线的停滞期减少提前进入对数生长期,SCF组及VEGF组于对照组的OD值相比较明显升高,统计分析表明有显著性差异(P<0.05),可见SCF及VEGF对毛乳头细胞的生长有明显的促进作用。结论:1在毛乳头的分离过程中我们利用改良毛乳头细胞培养法,用少量的标本,成功分离到了高纯度的毛乳头细胞,且体外培养的毛乳头细胞呈典型的凝聚性生长,α-平滑肌肌动蛋白表达阳性,毛乳头细胞在DMEM培养基中生长良好。改良毛乳头细胞培养法是一种快速、简单、经济的分离培养毛乳头细胞的方法。2毛乳头细胞体外培养时,低传代细胞表达SCF及VEGF较高传代细胞表达强,随着体外传代次数的增加SCF及VEGF的表达逐渐减弱。3 SCF及VEGF可以促进体外培养的毛乳头细胞的增殖。