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[研究背景]膝骨关节炎作为临床常见的慢性退行性骨关节疾病其临床表现多为疼痛、关节活动障碍。临床中根据患者病变的不同程度和主观疼痛将KOA分为初期、早期、中期和晚期四个阶段。采用阶梯治疗策略对KOA进行相关治疗和康复方面的研究,其中基础包括健康宣教、运动生活指导、科学合理的功能锻炼和中医药康复治疗。针刀疗法是一种新兴的中医理论指导下的生物力学干预疗法,临床治疗KOA疗效确切,课题组在前期研究中对中晚期制动6周KOA模型家兔展开相关实验研究,但是对早中期KOA家兔膝关节周围软组织的干预研究较少。所以本课题观察早中期制动4周KOA模型兔在针刀干预后膝关节周围软组织的力学性能变化,并通过纳米压痕、番红O/固绿染色、免疫荧光双标染色观察针刀对膝关节软骨结构的影响,同时应用ELISA检测血清、关节液中软骨代谢产物表达情况,进一步探索针刀“调筋治骨”治疗KOA的作用机制,为临床治疗KOA提供实验依据。[研究目的]基于改良Videman法制备4周KOA模型,探讨针刀对膝骨关节炎的治疗是否通过改变膝关节伸肌-屈肌的张力、弹性和生物力学从而影响关节软骨,明确不同分期伸肌-屈肌生物力学改变在软骨破坏降解中的作用,恢复软骨应力平衡减少损伤,阐明针刀治疗KOA的生物力学机制。基于行为学、形态学、生物力学及分子生物学检测方法观察针刀干预膝关节伸肌-屈肌生物力学条件下兔的步态、软骨代谢及结构变化、肌肉性能的改变;通过纳米压痕技术和酶联免疫吸附法检测兔膝关节软骨储存模量、损失模量、阻尼系数和兔关节囊滑液及血清中软骨降解产物软骨寡聚基质蛋白(COMP)和Ⅱ型胶原羧基端肽(CTX-Ⅱ)揭示针刀缓解关节软骨降解的机制,明确针刀治疗KOA的最佳治疗时间,阐释针刀“调筋治骨”法治疗KOA的生物力学等机制,为临床治疗提供实验依据和理论支持。[研究方法]57只新西兰兔按照体重由小到大排号,查随机数字表,按体重随机分为正常组9只、模型组、针刀组、电针组和西药组每组各12只。采用改良Videaman法对48只新西兰兔进行制动造模4周。解除制动3天后进行干预。正常组:每日进行抓取,同时给予纯水3 ml灌胃,每日1次,共4周。模型组:每日进行抓取,同时给予纯水3ml灌胃,每日1次,共4周。针刀组:每日进行抓取,同时给予纯水3ml灌胃,每日1次,同时在股内、外侧肌腱止点、股直肌肌腱止点、股二头肌肌腱止点、鹅足腱囊针刀、压痛结节点进行针刀干预,每周2次,共4周。电针组:对梁丘、血海、内膝眼、外膝眼、阴陵泉、阳陵泉、委中、曲泉进行电针干预,应用穴位神经刺激仪行电针刺激治疗,分别连接梁丘-委中,血海-曲泉(波形疏密波,频率2/100 Hz,强度2mA),每次20min,隔天治疗1次,共4周。西药组:每日进行抓取,按体重10 mg/kg给予塞来昔布灌胃,每日1次,干预4周。干预结束后,进行相关组织取材检测。采用改良的Lequesne MG膝关节评估量表对各组兔进行行为学评价;对兔股直肌-股二头肌进行HE染色及拉伸弹性模量等检测,以评估兔股直肌-股二头肌肌肉性能;对兔膝关节软骨进行纳米压痕、番红O/固绿染色以及免疫荧光双标染色等检测,以观察膝关节软骨结构变化;同时应用ELISA检测各组兔血清、关节液中软骨代谢产物(COMP,CTX-2)表达情况。[研究结果]1.Lequesne评分结果:模型组(6.22± 1.92)、针刀组(5.67±0.87)、电针组(5.89±0.93)和西药组(6.11±0.60),各组间差异无统计学意义(P>0.05)。干预治疗4周后,模型组Lequesne评分较前降低(4.67±1.12),与模型组相比,针刀组(3.33±0.71,P=0.002<0.01)、电针组(3.56±0.88,P=0.009<0.01)和西药组(3.11±0.60,P=0.000<0.01)Lequesne评分显著降低;针刀组与电针组差异无统计学意义(P=0.583)。2.各组兔肌肉HE染色结果:在固定视野内(10×20倍),模型组股直肌平均横截面积(1.44±0.11 ×10-1 mm2)与正常组(2.02±0.36 ×10-1mm2)相比显著缩小(P=0.000<0.01);干预治疗后,与模型组相比,针刀组股直肌平均横截面积显著增加(1.89±0.12 ×10-1mm2,P=0.000<0.01),电针组股直肌平均横截面积增加但无统计学差异(1.63 ± 0.29 × 10-1mm2,P=0.125),西药组股直肌平均横截面积显著增加(1.98±0.49 ×10-1mm2,P=0.000<0.01);针刀组与电针组相比,针刀组改善股直肌横截面积更佳(P=0.014<0.05)。固定视野内模型组股直肌肌纤维数(173.08±11.19条)与正常组(137.75±14.48条)相比显著升高(P=0.000<0.01);干预治疗后,与模型组相比,针刀组股直肌肌纤维数显著降低(140.35±15.81条,P=0.000<0.01),电针组股直肌肌纤维数表达降低但无统计学差异(159.42±27.68条,P=0.106),西药组股直肌肌纤维数明显降低(151.24±26.39条,P=0.013<0.05);针刀组与电针组相比,针刀组股直肌纤维数更少(P=0.014<0.05)。各组兔股二头肌固定视野内肌横截面积和肌纤维数比较在固定视野内(10×20倍),模型组股二头肌平均横截面积(1.37±0.22×10-1mm2)与正常组(2.30±0.30×10-1 mm2)相比显著缩小(P=0.000<0.01);干预治疗后,与模型组相比,针刀组股二头肌平均横截面积显著增加(1.88 ±0.32×10-1mm2,P=0.000<0.01),电针组股二头肌平均横截面积显著增加(1.84±0.29×10-1mm2,P=0.000<0.01),西药组股直肌平均横截面积显著增加(1.96±0.46 ×10-1 mm2,P=0.000<0.01);针刀组与电针组相比股二头肌平均横截面积无统计学差异(P=0.691)。模型组股二头肌肌纤维数(185.47±15.61条)与正常组(115.94±10.59条)相比显著升高(P=0.000<0.01);干预治疗后,与模型组相比,针刀组股二头肌肌纤维数显著降低(142.56±27.86条,P=0.000<0.01),电针组股二头肌肌纤维数显著降低(144.05±20.78条,P-=0.000<0.01),西药组股直肌肌纤维数显著降低(151.38±30.76条,P=0.000<0.01);针刀组与电针组相比,股二头肌纤维数无统计学差异(P=0.845)。3.各组兔伸肌-屈肌拉伸弹性模量结果:①各组兔股直肌拉伸弹性模量结果:与正常组相比,模型组股直肌整体EM值显著升高(2.122±0.529VS 0.878±0.269 MPa,,P=0.000<0.01);干预治疗后,与模型组相比,针刀组股直肌整体EM值显著降低(1.202±0.583 MPa,P=0.002<0.01),电针组股直肌整体 EM 值显著降低(1.054±0.167MPa,P=0.000<0.01),西药组股直肌整体EM值显著降低(1.164±0.291 MPa,P=0.001<0.01);同时针刀组与电针组相比,股直肌EM值差异无统计学意义(P=0.565)。②各组兔股二头肌拉伸弹性模量结果与正常组相比,模型组股二头肌整体EM值显著升高(0.775±0.173 VS 0.401 ±0.141 MPa,P=0.007<0.01);干预治疗后,与模型组相比,针刀组股二头肌整体EM值表达降低(0.668±0.202 MPa,P=0.406),电针组股二头肌整体EM值表达降低(0.647±0.290 MPa,P=0.320),西药组股二头肌整体 EM 值表达降低(0.700 ± 0.148 MPa,P=0.559)。4.各组兔膝关节软骨纳米压痕结果:①各组兔膝关节胫骨软骨纳米压痕结果:从整体数据看,模型组胫骨软骨SM值与正常组相比表达降低;干预治疗后,与模型组相比,针刀组胫骨软骨SM值表达升高,电针组胫骨软骨SM值明显升高(P<0.05),西药组胫骨软骨SM值表达稍升高。从平均值看,模型组胫骨SM值与正常组(5.74±0.68VS6.88±0.62 Pa,P=0.438)相比表达降低;干预治疗后,与模型组相比,针刀组胫骨SM值表达升高(8.79±2.32 Pa,P=0.056),电针组胫骨SM值表达明显升高(10.09±2.92 Pa,P=0.012<0.05),西药组胫骨SM值表达升高(6.35±0.43 Pa,P=0.675);同时,针刀组SM值与电针组相比无统计学差异。模型组胫骨软骨LM值与正常组相比表达降低;干预治疗后,与模型组相比,针刀组胫骨软骨LM值表达升高,电针组胫骨软骨LM值明显升高(P<0.05),西药组胫骨软骨LM值稍升高。从平均值看,模型组胫骨LM值与正常组(0.94±0.15VS 1.22±0.09 Pa,P=0.398)相比表达降低;干预治疗后,与模型组相比,针刀组胫骨LM值表达升高(1.56±0.65 Pa,P=0.073),电针组胫骨LM值表达明显升高(1.73±0.53 Pa,P=0.029<0.05),西药组胫骨 LM 值表达稍有升高(1.08±0.50 Pa,P=0.645)。模型组兔胫骨软骨LF值与正常组相比表达降低;干预治疗后,与模型组相比,针刀组胫骨软骨LF值表达升高,电针组胫骨软骨LF值升高,西药组胫骨软骨LF值升高。从平均值看,模型组胫骨LF值与正常组(0.163±0.008VS0.177±0.004,P=0.216)相比表达降低;干预治疗后,与模型组相比,针刀组(0.174±0.026,P=0.335)、电针组(0.173±0.006,P=0.363)、西药组(0.172 ± 0.008,P=0.410)胫骨 LF 值表达升高;同时,针刀组LF值与电针组相比无统计学差异。②各组兔膝关节股骨软骨纳米压痕结果:模型组股骨软骨SM值与正常组相比表达显著升高(P<0.01);干预治疗后,与模型组相比,针刀组股骨软骨SM值显著降低(P<0.01),电针组股骨软骨SM值显著降低(P<0.01),西药组股骨软骨SM值显著降低(P<0.01)。模型组股骨SM值与正常组(13.27± 3.61 VS 4.23±1.33 Pa,P=0.001<0.01)相比显著升高;干预治疗后,与模型组相比,针刀组股骨SM值显著降低(5.83±1.23 Pa,=0.003<0.01),电针组股骨SM值显著降低(6.21±0.74 Pa,P=0.004<0.01),西药组股骨 SM 值表达显著降低(5.78±3.34 Pa,P=0.003<0.01)。同时,针刀组与电针组SM值相比无统计学差异。从整体数据看,模型组股骨软骨LM值与正常组相比显著升高(P<0.01);干预治疗后,与模型组相比,针刀组股骨软骨LM值显著降低(P<0.01),电针组股骨软骨LM值显著降低(P<0.01),西药组股骨软骨LM值显著降低(P<0.01)。模型组股骨LM值与正常组(2.15 ± 0.39 VS 0.68±0.16 Pa,P=0.000<0.01)相比显著升高;干预治疗后,与模型组相比,针刀组股骨LM值显著降低(1.03±0.19 Pa,P=0.002<0.01),电针组股骨LM值显著降低(1.10±0.18 Pa,P=0.002<0.01),西药组股骨 LM 值显著降低(0.97±0.50Pa,P=0.001<0.01)。与正常组相比,模型组兔股骨软骨LF值在1 Hz、2.59Hz、6.708 Hz时表达升高,在17.374 Hz、45 Hz时,模型组股骨软骨LF值表达降低,但差异均无统计学意义;干预治疗后,与模型组相比,针刀组、电针组和西药组股骨软骨LF值表达均有升高趋势。从平均值看,模型组胫骨LF值与正常组(0.166±0.013VS0.163±0.014,P=0.788)相比表达升高;干预治疗后,与模型组相比,针刀组(0.178±0.006,P=0.218)、电针组(0.176±0.011,P=0.280)、西药组(0.174±0.013,P=0.426)胫骨LF值表达升高。5.各组兔软骨Mankin评分结果:与正常组相比(0± 0),模型组Mankin评分显著升高(5.12±1.65,P=0.000<0.01);干预治疗后,与模型组相比,针刀组Mankin评分明显降低(4.07±0.78,P=0.026<0.05),电针组 Mankin 评分显著降低(3.67±1.40,P=0.003<0.01),西药组 Mankin 评分明显降低(3.93±1.44,P=0.014<0.05)。6.各组兔免疫荧光染色结果:模型组细胞核数与正常组相比表达降低(39.00 ± 11.95 VS 47.33±6.14个,P=0.076);干预治疗后,与模型组相比,针刀组(48.37±8.62个,P=0.017<0.05)和西药组细胞核数(51.46±13.35,P=0.004<0.01)明显升高。同时,模型组细胞核IOD与正常组相比明显降低(218085±65522 VS 281656±47981,P=0.032<0.05);干预治疗后,与模型组相比,针刀组(264482±59410,P=0.058)与电针组(268533± 53436,P=0.051)细胞核IOD有所升高,但差异无统计学意义,西药组细胞核IOD显著升高(296503±96731,P=0.004<0.01)。模型组F-actin骨架蛋白IOD与正常组相比显著降低(427822± 114112 VS 591898±161368,P=0.005<0.01);干预治疗后,与模型组相比,针刀组(490082±93263,=0.184)和电针组(488292±101458,P=0.220)骨架蛋白IOD表达稍升高但无统计差异,西药组骨架蛋白IOD值表达明显升高(532521±185545,P=0.046<0.05)。核/骨架蛋白比值方面,模型组与正常组相比比值升高(0.55±0.23 VS 0.49 ± 0.09,P=0.486);干预治疗后,与模型组相比,针刀组(0.56±0.18,P=0.866)、电针组(0.59±0.23,P=0.596)和西药组(0.58±0.18,P=0.755)比值表达升高,但无统计学差异。模型组Ⅱ型胶原IOD与正常组相比显著降低(70567±26683 VS 133780±61671,P=0.001<0.01):干预治疗后,与模型组相比,针刀组(91485±36482,P=0.168)和电针组(89782±51996,P=0.236)Ⅱ型胶原IOD值表达升高但无统计学差异,西药组Ⅱ型胶原IOD 值明显升高(106694±30698,P=0.031<0.05)。7.各组兔血清和关节液中CTX-2和COMP含量结果:与正常组(5.92±1.15 ng/ml)相比,模型组血清CTX-2含量显著升高(8.37±0.89 ng/ml,P=0.001<0.01);干预治疗后,与模型组相比,针刀组血清CTX-2含量降低(7.22±1.36ng/ml,P=0.091),电针组血清CTX-2含量降低(8.07±1.26ng/ml,P=0.657),但无统计学意义;西药组血清CTX-2含量明显降低(6.86±0.99ng/ml,P=0.025<0.05);针刀组与电针组CTX-2含量相比无统计学差异(P=0.204)。与正常组(5.29±1.10 ng/ml)相比,模型组血清COMP含量显著升高(8.47 ± 1.64 ng/ml,P=0.000<0.01);干预治疗后,与模型组相比,针刀组血清COMP含量明显降低(6.61±1.39 ng/ml,P=0.014<0.05),电针组血清COMP含量降低,西药组血清COMP含量降低(6.99±0.99ng/ml,P=0.053)。模型组关节液中CTX-2含量与正常组相比表达升高(9.28±2.22VS 8.45±0.79ng/ml,P=0.231>0.05);干预治疗后,与模型组相比,针刀组关节液CTX-2含量表达降低(7.98±0.87 ng/ml,P=0.066),电针组关节液CTX-2含量表达明显降低(7.82±0.47 ng/ml,P=0.032<0.05),西药组关节液CTX-2含量表达显著降低(7.37±0.77 ng/ml,P=0.007<0.01)。模型组关节液中COMP含量与正常组相比表达升高(8.19±0.98VS 7.15±1.08 ng/ml,P=0.138);干预治疗后,与模型组相比,针刀组关节液COMP含量表达降低(7.48±1.14 ng/ml,P=0.283),电针组关节液COMP含量表达降低(7.38±1.13,P=0.244),西药组关节液COMP含量表达降低(7.28±1.71 ng/ml,P=0.194)。[研究结论]1.针刀干预早中期KOA模型兔,可显著改善膝关节功能活动。2.针刀干预早中期KOA模型兔,可直接改善股直肌-股二头肌萎缩状态,明显降低相应拉伸弹性模量,从而间接改善膝关节软骨承受的异常生物力。3.针刀干预早中期KOA模型兔,可显著降低关节软骨病理损伤,部分改善软骨粘弹性能,部分缓解软骨细胞外基质的降解,从而发挥治疗作用,即“调筋治骨”。