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[目的]癌症是全球范围内导致人类死亡的主要原因之一,细胞免疫疗法主要通过调节免疫细胞的功能使其靶向杀伤癌细胞,且副作用较小。近年来,嵌合抗原受体T细胞（CAR-T,Chimeric Antigen Receptor T cell）由于有明确的靶向性,已被证明是治疗癌症最有希望的免疫细胞。特别是靶向CD19的CAR-T细胞在治疗B系白血病和淋巴细胞瘤方面取得显著疗效。但CAR-T细胞如何在体外进一步优化增殖效率及延长其体内持久性仍是急需解决的问题。磁珠与人工抗原提呈细胞（aAPC,artificial antigen-presenting cells）是两种最常用于体外扩增刺激CAR-T细胞的方法,但两种方法培养出的CAR-T细胞各自的特点未见系统比较报道。此外,细胞因子白介素-7（IL-7）作为诱导T细胞活化、增殖和细胞毒活性的关键组成部分,已被证明能够显著增强CAR-T细胞的记忆活性,但促进CAR-T细胞增殖及其具体机制还有待验证及进一步阐述。miRNAs参与T细胞的激活和免疫应答,在T细胞活性和提高存活率中起到重要作用。然而miRNA是否参与到IL-7对CAR-T细胞的激活暂未见报道。基于我们的前期研究以及文献调研,本课题提出以下科学问题:1)磁珠与aAPC刺激培养的抗CD19 CAR-T细胞是否具有相同增殖效率,细胞表型及记忆功能和耗竭性?2)IL-7是否能促进抗CD19 CAR-T细胞的增殖?3)寻找参与IL-7对抗CD19 CAR-T细胞调控的关键miRNA,并了解其具体调控机制。为了验证及阐明以上科学问题,本研究拟利用同一捐赠者（重复样本5-6）的外周血白细胞分别采用两种扩增方法（磁珠与aAPC）对piggyBac转座子酶电转构建的第三代CAR-T细胞的增殖效率、记忆表型及耗竭分子表达进行比较;将从IL-7细胞因子增强T细胞存活与稳态增殖的基础上,利用全转录组测序寻找IL-7调控CAR-T激活的关键miRNA与基因;进一步阐述IL-7通过增加miRNA-98-5p的表达诱导关键基因CDKN1A减少,从而影响下游蛋白CDKs/Cyclins表达水平,最终促进CAR-T细胞的存活与稳态增殖。本课题研究结果将优化piggyBac电转构建的抗CD19 CAR-T细胞的培养,并对CAR-T细胞的功能及活性调控分子机制做出阐述,为其能够更好的在临床上应用提供科学依据及技术支持。[方法]第一部分:利用电穿孔转染技术将构建的CD19 PiggyBac转座子与转座酶质粒转入T细胞体内进行修饰改造,并将CAR-T细胞与人工抗原提呈细胞CD19CD137LCD86CD64mIL-15-K562或抗 CD3/CD28 磁珠按照一定的比例进行共培养,加入相应的细胞因子。镜下观察两组CAR-T细胞生长状态与增殖情况。qPCR及琼脂糖凝胶实验验证aAPC在培养CAR-T细胞中的残留,以及流式细胞术观察aAPC的GFP表达。在刺激的过程中采用流式细胞检测术检测CD3,CD4,CD8分群情况,CAR标志myc的表达,CAR-T细胞的记忆亚群表达,及CAR-T细胞的耗竭情况。利用荧光素酶杀瘤实验检测CAR-T细胞的抗肿瘤效应,采用Elisa实验验证两种方法刺激的CAR-T细胞分泌的细胞因子。电镜观察CAR-T细胞杀伤Raji肿瘤细胞,利用蛋白免疫印迹（western blot,WB）验证CAR-T细胞杀伤肿瘤的机制。第二部分:同样利用电穿孔转染技术将构建的CD1 9PiggyBac转座子与转座酶质粒转入T细胞进行修饰改造,按照一定的比例加入抗CD3/CD28磁珠刺激扩增CAR-T细胞,分为两组分别加入不同的细胞因子（IL-7+IL-2+IL-21 VS IL-2+IL-21）。镜下观察两组CAR-T细胞生长状态与增殖情况。在刺激的过程中采用流式细胞检测术检测CD3,CD4,CD8表达情况,CAR标志myc的表达,CAR-T细胞的记忆亚群表达,CAR-T细胞的耗竭分布。利用荧光素酶杀瘤实-验检测CAR-T细胞的抗肿瘤效应,采用Elisa实验验证两种方法刺激的CAR-T细胞分泌的细胞因子。通过尾静脉注射NAMALWA肿瘤细胞构建NAMALWA异种移植小鼠模型,再次尾静脉注射两组1.8×107个CAR-T细胞与对照组T细胞。第三部分:利用第二部分相同方法刺激两组CAR-T细胞,提取两组CAR-T细胞的RNA,采用全转录组测序技术对其测序,利用生物信息学技术寻找有差异的mRNA与miRNA,扩大样本量,qPCR实验验证mRNA与miRNA的表达,筛选出显著高表达的目的mRNA与miRNA。利用GO与KEGG富集分析,选取与增殖相关的基因CDKN1A,通过WB检测下游增殖相关的标志:CDK2、CDK4、CyclinDl、CyclinE1,利用EdU与流式检测细胞的增殖与周期。通过TargetScan与miRanda软件预测CDKN1A的相关miRNA,再转染相关miRNA的mimics与抑制剂,WB检测下游增殖相关的标志:CDK2、CDK4、CyclinD1、CyclinE1,利用EdU与流式检测细胞的增殖与周期。[结果]第一部分:通过aAPC与抗CD3/CD28磁珠两种刺激扩增的方法,成功获得两组CAR-T细胞。aAPC刺激培养的CAR-T细胞生长状态比磁珠组扩增的更良好及增殖倍数更高,qPCR及琼脂糖凝胶实验验证aAPC在培养CAR-T细胞中没有存在残留,以及流式细胞术未观察到aAPC的GFP表达。流式细胞术检测aAPC刺激培养的CAR-T细胞能改变CD4+CAR/CD8+CAR-T细胞的比例,CD45RO+CAR-T记忆细胞亚群表达更多。qRT-PCR验证aAPC刺激培养的CAR-T细胞耗竭分子CTLA-4表达更低。体外杀瘤实验检测磁珠刺激培养的CAR-T细胞抗肿瘤效应更强,Elisa实验验证两组CAR-T细胞分泌的细胞因子无较大差异。WB验证CAR-T组显著增加STAT1、裂解-caspase 3和Bax的表达,而caspase 3的表达下降到检测不到的水平。第二部分:在磁珠刺激扩增CAR-T细胞的前提下,通过利用两组不同细胞因子组合进行共培养刺激,成功获得两组CAR-T细胞。IL-7刺激培养的CAR-T细胞生长状态比未加IL-7刺激扩增的更良好及增殖倍数更高,流式细胞术检测IL-7刺激培养的CAR-T细胞能改变CD4+CAR/CD8+CAR-T细胞的比例,记忆细胞亚群与耗竭分子表达无显著差异。体外杀瘤实验表明未加IL-7刺激培养的CAR-T细胞抗肿瘤效应更强,Elisa实验验证两组CAR-T细胞分泌的细胞因子无较大差异。而体内实验NAMALWA肿瘤异种移植瘤模型证明IL-7刺激培养的CAR-T细胞在后续表现出显著的抗肿瘤作用。第三部分:通过全转录组测序及生物信息学分析,结果表明有52个mRNA和8个miRNA具有显著差异。qPCR验证,我们发现CDKN1A、FAM110A、GPC1、KLHL29、TSN具有显著差异,其中KLHL29在IL-7组中上调,CDKN1A、FAM110A、GPC1、与TSN在IL-7组中下调,其中通过WB检测CDKN1A可能影响CAR-T细胞的增殖。同时生物信息学分析及qPCR验证,发现has-miR-320a-5p与has-miR-1973具有显著差异,在IL-7组中下调,但has-miR-98-5p在IL-7组中升高。模拟miR-98-5p与抑制miR-98-5p均会改变CDKN1A及下游相关增殖蛋白CDK2、CDK4、CyclinD1、CyclinE1的表达,流式周期检测发现IL-7会影响细胞周期S期的比例。同时发现IL-7也会影响T细胞的增殖。我们猜测IL-7可能通过miRNA下调CDKN1A的表达从而影响CAR-T细胞的增殖。[结论]1、与磁珠刺激CAR-T细胞相比较,aAPCs更能显著增强CAR-T细胞增殖,记忆表型表达更高和耗竭分子表达更低;aAPCs刺激的CAR-T细胞可通过激活细胞因子IFN-γ等及凋亡相关途径发挥体外抗肿瘤效应;在移植肿瘤小鼠模型表现出显著的抗肿瘤作用。2、IL-7能促进CAR-T细胞增殖,与aAPCs刺激组的CAR-T细胞扩增倍数相比无显著差别,并能改变CD4+CAR/CD8+CAR-T细胞的比例,在体内实验表现出显著的抗肿瘤作用。3、通过全转录组测序及验证发现IL-7能通过介导miRNA-98-5p下调CDKN1A增殖基因表达从而影响CAR-T细胞的增殖。