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研究背景:人脑胶质瘤(glioma)是一种神经上皮组织来源的肿瘤,系最常见的原发性颅内肿瘤[1]。任何年龄段患者均可发病,主要集中在45-70岁,平均年龄约53岁,青年患者非常少见。根据世界卫生组织(WHO)脑胶质瘤分级,Ⅰ～Ⅱ级为低级别胶质瘤,Ⅲ～Ⅳ级为高级别胶质瘤,占胶质瘤总数的77.5%。Ⅲ级胶质瘤主要病理类型为间变星形细胞瘤(anaplasticglioma,AA),Ⅳ级主要为多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme,GBM),也称胶质母细胞瘤。高级别胶质瘤具有分化程度低,恶性程度高,侵袭性强,易复发及病死率高等特点,给患者的预后及生活质量带来严重影响。遗憾的是,GBM放射治疗的效果尚有争议。随着对GBM不断深入研究,学者们认识到纳米药物用于高级别胶质瘤高效放疗有助于解决这一难题,并进行了深入探索。目的:本研究旨在构建一种可以增强人脑胶质瘤放疗敏感性的纳米药物递送系统,探讨AU@GA对人脑胶质瘤U251体外放疗增敏效果及安全性分析。材料和方法1.柠檬酸三钠与四氯金酸三水合物在一定反应条件下以适当比例反应,制备出纳米级别的金纳米颗粒。同时利用透射电镜及动态光散射仪对金纳米颗粒进行表征,利用电感耦合等离子体原子发射光谱法对制备的金纳米颗粒溶液浓度进行测量。通过物理搅拌吸附法将没食子酸载到金纳米颗粒上,利用紫外线分光光度仪间接测定金纳米颗粒的载药量及最佳投料比。2.培养人脑胶质瘤细胞U251,分别给予细胞不同放射剂量和不同药物浓度,利用MTT法检测放射剂量及药物对胶质瘤细胞的毒性和细胞存活率的影响。利用流式细胞仪检测细胞凋亡、细胞周期以及western blot对AU@GA放疗增敏机制进行研究。结果:1.透射电镜下观察制备的金纳米颗粒发现,金纳米颗粒呈圆形,大小形状相对均一规则,平均直径为20±0.65纳米,分散性良好,颗粒之间无明显融合黏连。2.金纳米颗粒溶液在DLS下观察发现,金纳米颗粒平均直径大小为23±0.34nm,考虑水分子包裹金纳米颗粒导致粒径稍大于透射电镜下金纳米颗粒直径。同时通过粒径分布图像可知粒径分布均匀,二者检测结果基本一致。3.ICP-AES检测的金纳米粒(金元素)的实际浓度为44.80μg/ml,则金元素的实际回收率为91.24%。4.利用紫外线分光光度仪进行没食子酸溶液扫谱,发现在265nm处有最大吸收峰。在265nm处进行GA标准曲线绘制。得到线性方程:Y=0.04193X+0.00552,相关系数R2=0.99981,最佳投料比为1:1。5.分别对实验阴性对照组、最低剂量组、中等剂量组和最高剂量组酸碱度值的测定中发现,阴性对照组PH为7.39±0.056,最低剂量组、中等剂量组和最高剂量组的 PH 值分别为 7.34±0.041、7.20±0.0251、7.11±0.055。6.正常神经胶质细胞在金纳米颗粒条件下培养,以对照组为参照标准第一天(98%VS 95.25%VS 94.25%VS 94.75%)、第二天(96.5%VS 95%VS 93.25%VS 93.75%)和第三天(95.5%VS 93.25%VS 93.75%VS 92.75%)各不同浓度金纳米颗粒实验组细胞存活率略低于对照组,但无统计学意义(P>0.05)。正常神经胶质细胞在不同浓度没食子酸条件下培养,以对照组为参照标准第一天(97.5%VS 83%VS 76.25%VS 64.5%)、第二天(95.25%VS 63.25%VS 56.25%VS 51.6%)和第三天(97.75%VS 47%VS 45.5%VS 43.25%)各不同浓度没食子酸实验组细胞存活率明显低于对照组,有统计学意义(P<0.05)。正常神经胶质细胞在不同浓度Au@GA条件下培养,以对照组为参照标准第一天(98.25%VS 92%VS 86%VS 83.5%)、第二天(87.75%VS 83.75%VS 87.5%VS 75.5%)和第三天(97.25%VS 70.25%VS 70%VS 68.75%)各不同浓度没食子酸实验组细胞存活率低于对照组,有统计学意义(P<0.05),但降低程度小于单独使用GA.组且二者降低差异有统计学意义(P<0.05)。7.通过分析6MV放射治疗及联合治疗后正常神经胶质细胞的生存率情况可以看出在放射剂量为8Gy时,放疗联合100 μ g金纳米颗粒与单纯放疗相比有显著性差异(P=0.0237<0.05);放疗联合100 μ g没食子酸与单纯放疗相比有显著性差异(P=0.0201<0.05);放疗联合100 μgAu@GA与单纯放疗相比有显著性差异(P=0.0002<0.01);8.通过分析6MV放射治疗及联合治疗后人脑胶质瘤U251细胞的生存率情况可以看出在放射剂量为8Gy时,放疗联合100 μ g金纳米颗粒与单纯放疗相比有显著性差异(P=0.006<0.01);放疗联合100 μ g没食子酸与单纯放疗相比有显著性差异(P=0.001<0.01);放疗联合100 μ gAu@GA与单纯放疗相比有显著性差异(P=0.003<0.01);9.人脑胶质瘤U251细胞经过150 μ g不同药物联合放疗处理后,可以发现各组细胞所处细胞周期比例不同。对照组细胞周期G2/M期为9.89%,G0/G1期为47.65;单纯使用金纳米颗粒组细胞周期G2/M期为12.23%,G0/G1期为36.87%;单纯使用没食子酸组细胞周期G2/M期为19.32%,G0/G1期为29.43%;Au@GA组细胞周期G2/M期为25.65%,G0/G1期为29.43%;从各组细胞周期变化可以看出与对照组相比添加药物金纳米、没食子酸及Au@GA均可以增加G2/M期所占比例,降低G0/G1期所占比例。各组G2/M期与G0/G1期与对照组相比,均具有统计学差异(P<0.05)。10.人脑胶质瘤U251细胞经过150 μ g不同药物联合放疗处理后,通过凋亡试剂盒分析不同组别细胞凋亡情况。对照组细胞凋亡百分数为:5.23±1.68%,单纯使用金纳米颗粒组凋亡百分数为:6.12±1.22%,单纯使用没食子酸细胞凋亡百分数为14.43±3.46%,Au@GA组细胞凋亡百分数为:13.22±2.12%。单纯给予6兆伏8Gy细胞凋亡分数为19.35±2.56%,金纳米颗粒联合放疗组百分数为:27.72±1.84%,没食子酸联合放疗组:38.52±3.15%,Au@GA联合放疗组为45.32±2.87%。与对照组相比,金纳米颗粒组细胞凋亡情况未见明显差异;GA组与Au@GA组有统计学差异。Au@GA联合放疗组与单纯放疗组及金纳米颗粒或GA联合放疗组比均有明显统计学差异。结论:1.通过本实验金纳米颗粒合成方式可以合成出平均直径为20±0.65纳米,分散性良好,颗粒之间无明显融合黏连的金纳米颗粒。2.金纳米颗粒未对正常神经胶质细胞表现出明显细胞毒性,没食子酸对正常神经胶质细胞和脑胶质瘤U251细胞均有不同程度的抑制,对胶质瘤细胞的抑制程度更明显。Au@GA可以减弱单纯没食子酸的细胞毒性。金纳米颗粒可以提高胶质瘤的放疗敏感性,Au@GA可以显著提高肿瘤的放疗增敏作用。