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胆管癌是肝胆系统常见的恶性肿瘤,近年来,其发病率有逐年上升的趋势。研究表明,脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophicfactor,BDNF)和酪氨酸激酶受体B(tyrosine kinase receptor B,TrkB)在多种恶性肿瘤中高表达,并与肿瘤细胞增殖、失巢凋亡、侵袭转移等恶性生物学行为有关。粘着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)也在多种恶性肿瘤中高表达,同时与细胞周期调控、增殖、凋亡、迁移、侵袭转移及血管生成等密切相关。本研究的目的,1.检测胆管癌组织中BDNF和TrkB蛋白的表达,探讨其表达与临床病理特征的关系;2.在体外检测BDNF对胆管癌细胞株QBC939增殖、凋亡、粘附、侵袭等生物学行为的影响,同时检测了其对FAK表达的影响;3.通过动物实验,观察外源性BDNF对胆管癌细胞株QBC939裸鼠移植瘤生长和FAK表达的影响。第一章BDNF和TrkB在胆管癌中的表达及其临床意义目的:检测胆管癌和正常胆管组织中BDNF和TrkB蛋白的表达,分析其表达与临床病理特征的关系。方法:免疫组化SP法检测42例胆管癌和10例正常胆管石蜡切片标本中BDNF和TrkB蛋白的表达。结果:正常胆管组织中无BDNF和TrkB蛋白的表达,胆管癌组织中BDNF和TrkB蛋白的表达率分别为71.4%(30/42)和69.0%(29/42)。BDNF和TrkB表达与分化程度、有无淋巴结转移和远处转移有关,而与性别、年龄、肿瘤大小无关。BDNF蛋白在低分化组、有淋巴结转移组和有远处转移组中的表达率分别为92.9%、90.0%、93.3%,均高于高中分化组,无淋巴结转移组和远处转移组的60.7%、54.5%、59.3%(p＜0.05)。TrkB蛋白在低分化组、有淋巴结转移组和有远处转移组中的表达率分别为100%、90.0%、93.3%,均高于高中分化组,无淋巴结转移组和无远处转移组的53.6%、50.0%、55.6%(p＜0.05)。BDNF与TrkB在胆管癌中的表达呈正相关(r=0.736,p＜0.01)。结论:BDNF和TrkB在胆管癌组织中呈高表达,而在正常胆管组织中无表达;二者的表达与胆管癌的低分化、淋巴结转移和远处转移有关;两者的表达呈正相关。第二章BDNF对胆管癌细胞株QBC939作用的实验研究目的:探讨外源性BDNF对胆管癌细胞株QBC939生物学行为和FAK表达的影响。方法:实验分组:对照组、低浓度组、中浓度组和高浓度组。各组胆管癌细胞,分别予不含BDNF RPMI-1640培养基,和含终浓度为25ng/ml、50ng/ml和100ng/ml BDNF RPMI-1640培养基培养。(1)免疫细胞化学检测细胞株QBC939的BDNF和TrkB蛋白表达;(2)MTT比色法检测细胞增殖;(3)用Poly-HEMA处理过的培养板建立失巢凋亡悬浮细胞培养模型,流式细胞术检测失巢凋亡率;(4)粘附实验检测细胞异质粘附能力;(5)Transwell侵袭小室法检测侵袭能力;(6)RT-PCR和Western Blot分别检测FAK mRNA和蛋白表达。结果:(1)免疫细胞化学检测提示:胆管癌细胞株QBC939中存在BDNF和TrkB蛋白表达;(2)MTT比色法检查发现:各浓度的外源性BDNF均能增强细胞的增殖能力,50ng/ml和100ng/ml较25ng/ml作用强,而50ng/ml和100ng/ml之间无显著性差别;(3)流式细胞术检测失巢凋亡率显示:各浓度的BDNF均能增强细胞抵抗失巢凋亡的能力,各浓度之间无显著性差别;(4)粘附实验显示:各浓度的BDNF均能增强细胞的粘附能力,各浓度之间无显著性差别;(5)Transwell侵袭小室法显示:BDNF呈浓度梯度依赖性增强细胞侵袭能力;(6)RT-PCR显示:各浓度的BDNF均可上调细胞FAK mRNA的表达,各浓度之间无显著性差别;Western Blot显示:各浓度的BDNF均可上调细胞FAK蛋白的表达,各浓度之间无显著性差别。结论:1.BDNF和TrkB蛋白在胆管癌细胞株QBC939中呈阳性表达;2.外源性BDNF能促进胆管癌细胞株QBC939增殖,增强其抵抗失巢凋亡的能力,并能增强其粘附、侵袭能力;3.外源性BDNF能上调胆管癌细胞株QBC939 FAK mRNA和蛋白的表达。第三章BDNF对胆管癌细胞株QBC939裸鼠皮下移植瘤作用的实验研究目的:探讨外源性BDNF对胆管癌细胞株QBC939裸鼠移植瘤生长的影响,并探讨其对移植瘤组织FAK表达的影响。方法:制备胆管癌裸鼠皮下移植瘤模型,实验分组:裸鼠16只,随机分成对照组和实验组,每组8只。实验组在接种部位皮下注射外源性BDNF,对照组在相同部位皮下注射等量生理盐水,检测指标:(1)移植瘤生长速度,移植瘤体积和重量;(2)HE染色,观察组织学形态;(3)免疫组织化学(SP法)检测有无BDNF和TrkB蛋白表达;(4)RT-PCR和Western Blot分别检测FAK mRNA和蛋白表达。结果:成功建立了人胆管癌细胞株QBC939裸鼠皮下移植瘤模型,成瘤率100%。(1)外源性BDNF能促进移植瘤的生长,实验组移植瘤生长速度快,体积和重量都较对照组大;(2)HE染色显示:两组移植瘤均有胆管癌的典型组织学表现;(3)免疫组织化学显示:两组移植瘤组织中均存在BDNF和TrkB蛋白表达;(4)RT-PCR显示:BDNF能上调移植瘤组织FAK mRNA的表达;Western Blot显示:BDNF能上调移植瘤组织FAK蛋白的表达。结论1.外源性BDNF能促进胆管癌细胞株QBC939裸鼠皮下移植瘤的生长;2.BDNF和TrkB蛋白在胆管癌细胞株QBC939裸鼠皮下移植瘤组织中呈阳性表达;3.外源性BDNF能上调胆管癌细胞株QBC939裸鼠皮下移植瘤组织FAK mRNA和蛋白的表达。