目的本研究拟通过体外分离、培养及鉴定人乳牙牙髓干细胞后,探讨二氢杨梅素对人乳牙牙髓干细胞的活性及成骨分化能力的影响,浅探二氢杨梅素与乳牙牙髓干细胞在治疗牙周疾病中的可能性。方法1.采用组织块法及有限稀释法获取人乳牙牙髓干细胞,在倒置显微镜下观察细胞的生长状况,免疫荧光组织化学及流式细胞仪检测细胞表面标志物来鉴定细胞来源,CCK-8法绘制细胞生长曲线,并对细胞进行成脂及成骨诱导分化;2.采用CCK-8法、碱性磷酸酶试剂盒及实时荧光定量PCR检测0.02μM、0.1μM、0.5μM、2μM、10μM及50μM浓度的二氢杨梅素对人乳牙牙髓干细胞的活性及骨向分化能力的影响。结果1.镜下观察见细胞在第7 d左右从组织块中爬出,细胞生长状态良好;免疫荧光组织化学结果为:第3代SHED波形丝蛋白在胞浆内表达阳性,角蛋白表达阴性;流式细胞仪检测发现细胞CD146、CD105表达阳性,CD34、CD45表达阴性;第4代SHED生长曲线呈现“S”型;SHED成脂诱导3周后油红O染色见细胞中有红色脂滴形成;SHED成骨诱导4周后茜素红染色形成红染的矿化结节。2.二氢杨梅素对SHED细胞活性的影响CCK-8结果显示:0.02μM、0.1μM、0.5μM、2μM、10μM及50μM浓度的二氢杨梅素在第24 h、48 h及72 h时与不含二氢杨梅素对照组相比,增值能力无显著差异(P>0.05),说明试验设置的各浓度的二氢杨梅素对SHED无明显的细胞毒性。3.二氢杨梅素对SHED成骨分化能力的影响⑴二氢杨梅素对SHED碱性磷酸酶活性的影响10μM及50μM浓度的二氢杨梅素组与对照组相比,可促进SHED碱性磷酸酶的活性(P<0.05);而0.02μM、0.1μM、0.5μM及2μM浓度的二氢杨梅素组的ALP活性与对照组相比无统计学差异(P>0.05)。⑵二氢杨梅素对SHED RUNX2及OCN mRNA表达的影响RUNX2 mRNA表达结果为:0.5μM、2μM、10μM及50μM浓度的二氢杨梅素组RUNX2 mRNA的表达与对照组相比要高(P<0.05);OCN mRNA表达变化为:2μM、10μM及50μM浓度的二氢杨梅素组与对照组相比,OCN mRNA的表达成上调趋势(P<0.05)。结论1.组织块法及有限稀释法可成功培养出人乳牙牙髓干细胞,人乳牙牙髓干细胞在一定诱导条件下可向成骨及成脂方向分化;2.一定浓度的二氢杨梅素对人乳牙牙髓干细胞无明显的细胞毒性;3.一定浓度的二氢杨梅素可促进人乳牙牙髓干细胞的骨向分化能力;4.本实验为二氢杨梅素与人乳牙牙髓干细胞结合应用于牙周组织的再生提供了一定的参考价值,但其中的作用机制还需进一步的研究。