实验背景:正在发育和成熟的神经系统中神经元的命运一部分是被神经营养因子家族的成员所掌控的。该家族成员包括神经生长因子(NGF)、脑源性神经生长因子(BDNF)、营养因子-3(NT-3)及营养因子4/5(NT-4/5)。从细胞中分泌的神经营养因子到达靶区域后,可以保护神经元、避免凋亡,仅有那些获得充足营养因子的神经元才能生存。NGF可以促进神经元前体细胞的增殖和分化;BDNF除了可以促进神经元的生存和修复损伤功能之外,还在突触的功能可塑性、神经递质与神经肽的产生和兴奋性方面发挥了重大作用;GDNF可提高多巴胺神经元和运动神经元的生存率;NT-3可以促进CNS和PNS中不同类型的神经元的生长、分化、包括神经巢细胞和少突胶质细胞的前体。大量的研究均表明,神经营养因子对神经元的生存、分化以及突触可塑性方面有着重要的作用,它们已经成为运动神经元退行性病变、肌萎缩侧索硬化(ALS)、脊髓性肌萎缩、小儿麻痹症后期综合症临床治疗的候选药物;而且也是治疗癫痫发作,阿尔茨海默病,帕金森病等神经退行性疾病的潜在药物。实验目的:本研究从神经系统特异表达的新基因NDNF入手,对其生物学功能进行初步研究,并确定了其表达的空间定位及与发育的关系,希望能够更好地理解神经系统的发育过程与机制,也希望能为中枢神经系统退行性疾病提供一定的临床治疗依据。实验方法:本课题分别使用分子生物学技术和形态学方法来研究NDNF的功能和时空发育的变化。通过序列比对和保守性分析,确定目的基因,使用PCR技术克隆目的基因,并构建真核表达系统。转染入真核细胞中获取含重组蛋白的培养基,作用于原代培养的海马神经元细胞,观察神经元形态的变化。transwell迁移实验,研究NDNF对神经元的迁移的影响。免疫印迹实验用来证实该基因在各组织中的表达情况。使用人工合成的肽段制备抗体,进行免疫荧光和免疫组化研究,分别观察E16-P90龄老鼠脑内NDNF的时间和空间的分布特点。实验结果:1.基因克隆与载体构建基因克隆测序结果与数据库相符。真核载体构建成功,转染入真核细胞后,定位在高尔基体和内质网区,具有糖基化修饰,这些均符合预测的分泌蛋白特征。培养基使用Western blot证实NDNF确实可以分泌。2.对神经元的营养功能含重组蛋白的培养基作用于原代培养的海马锥体神经元,与对照组相比,神经元的突起明显长于对照组,胞体直径明显大于对照组。Transwell实验进一步证实了NDNF不仅对神经元有营养作用,而且还可促进神经元的迁移。通过与BDNF对神经元的迁移作用相比,可以发现NDNF对神经元具有很强的营养作用。3. NDNF的组织分布和发育学特点分别从小鼠大脑、脊髓、肝脏、心脏和肾脏中提取蛋白,Western blot实验证实了NDNF仅在大脑和脊髓中存在,免疫荧光实验进一步证实了该结论,而且在神经系统的定位与神经元符合,而不是星型胶质细胞表达。大脑皮层Cajal-Retzius细胞、小脑浦肯野细胞表达水平较高。NDNF从胚胎期到成年小鼠一直表达,且与神经元数目相关。结论:NDNF基因在进化上相当保守,属于分泌类型蛋白,是神经元自身分泌的、且主要对自身起营养支持作用的新型神经营养因子。体外实验证明可促进神经元向外迁移、分化和成熟。NDNF在中枢神经系统神经元中广泛表达,从胚胎期开始表达,一直持续到成年,且其表达量随着神经元的减少而减少。