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纳米材料在生命科学领域有着巨大的应用价值,同时也使人们注意到可能产生的潜在危害,迫切需要全面、深入地研究纳米材料与细胞的作用。基因表达谱在研究纳米材料与细胞作用中已经受到广泛研究,但由于其检测对象mRNAs低稳定性及存在转录后翻译调控的作用机制,现有的基因表达谱分析在准确反映蛋白表达差异方面存在缺陷。microRNAs(miRNAs)是一类内源性小RNA分子,参与调控多种生物学过程,能反映转录后基因表达水平。因此,microRNA表达谱用于研究纳米材料与细胞作用更具优势。本论文发展了基于microRNA表达谱的纳米材料与细胞作用的研究方法,并应用于三种典型纳米材料,即Fe2O3纳米颗粒(Fe2O3Nanoparticles,Fe2O3 NPs)、多壁碳纳米管(Mutiwall Carbon Nanotubes,MW-CNTs)和CdTe量子点(CdTe Quantum Dots,CdTe QDs),对细胞作用效应的研究,取得如下创新性研究成果:
1、通过三种典型纳米材料Fe2O3 NPs、MW-CNTs、CdTe QDs与NIH/3T3细胞作用后microRNAs表达差异的研究,揭示了microRNAs为纳米材料与细胞作用过程调控的参与者。研究结果表明:纳米材料作用于细胞后,凋亡相关microRNAs的表达水平会发生显著变化,并且具有对纳米材料浓度的依赖性,与传统检测手段的检测结果具有较好的相关性。Fe2O3NPs和CdTe QDs与细胞作用中,明显抑制miR-21表达而促进miR-34a、miR-34c表达,表明这两种纳米材料可显著诱发细胞凋亡,与显微镜观察结果较为一致。而miR-29a、miR-29b和miR-29c在三种纳米材料处理细胞中不同的变化趋势,亦反映了纳米材料的作用特性。
2、发展了通过microRNA表达谱研究纳米材料与细胞作用的新方法。应用SOLiD高通量测序技术检测出Fe2O3 NPs、MW-CNTs、CdTe QDs与NIH/3T3细胞作用后所有microRNA的表达量,并据之研究纳米材料与细胞复杂的作用效应。创新性地将Z-test应用于microRNA表达谱的分析,使纳米材料与细胞作用中microRNAs的表达差异分析既包含了microRNA的倍数变化又体现microRNA的数量作用,从而使microRNA表达差异的研究更为合理,为选择特异性microRNA研究提供更可靠的依据。
3、提出了系统分析microRNA表达谱的新的数学模型,并成功地用于研究纳米材料与细胞的作用,从microRNA转录后调控角度全面理解纳米材料的生物学效应。在该数学模型中,我们充分考虑了microRNA对不同靶基因的作用特点,将测序得到的所有microRNAs都作为对靶mRNAs的调控网络单元。分析结果表明,纳米材料与细胞作用中microRNAs全面调控其靶mRNAs翻译;通过对表达水平显著变化的基因进行DAVID分析,得到了KEGG信号传导途径、GO调控过程和GO代谢过程受到纳米材料的影响规律,也印证了microRNA表达差异是细胞对纳米材料刺激的主动调节过程。
4、深入研究了CdTe QDs对NIH/3T3细胞作用的microRNA差异表达的调控机制。研究结果表明:p53蛋白表达及其磷酸化在CdTe QDs作用后明显增多,而其mRNA的转录却未发生明显变化,活化的p53蛋白促进了其靶microRNA基因(miR-34a、miR-34b和miR-34c)的转录而提高相应的pri-microRNA表达水平,同时p53蛋白增多也加快了pri-microRNA的剪切,促进了microRNAs的成熟。P53蛋白通过调控其靶microRNA的转录及pri-microRNA剪切而参与调控CdTe QDs与细胞作用中microRNA的差异表达。