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昆虫是地球上种类和数量最多的一种生物,与人类的生活息息相关。一方面,农业害虫和传播疾病的载体昆虫会给人类生活带来灾难性的影响;另一方面,也有许多昆虫如蜜蜂和家蚕等有益于人类的生活。相对于其他动物,昆虫具有突出的环境适应能力和种群繁衍能力,这很大程度上归功于它们拥有极其灵敏的嗅觉系统。在长期的进化过程中,昆虫进化出各种化学感受器,尤其是嗅觉感受器来感知大自然中千变万化的化学气味分子,并产生一系列相应的行为和生理反应,比如觅食、产卵、求偶、交配、防御等。昆虫对于气味物质的识别过程涉及多个蛋白,包括气味受体(Odorant receptor,OR)、离子型受体(Ionotropic receptor,IR)、气味结合蛋白(Odorant binding protein,OBP)、化学感受蛋白(Chemosensory protein,CSP)、感觉神经元膜蛋白(Sensory neuron membrane protein,SNMP)和气味降解酶(Odorant degrading enzyme,ODE)等。随着DNA测序技术和分子生物学技术的快速发展,深入研究昆虫嗅觉识别机制成为可能,这也是当今昆虫学研究的热门领域之一。在深入研究昆虫嗅觉感受机制的基础上,我们可以以嗅觉基因为靶标高通量筛选高活性的气味分子,进而为开发高效的昆虫行为调控剂奠定理论基础。本研究以重要农业害虫绿盲蝽(Apolyguslucorum)和苜蓿盲蝽(Adelphocorilineolatus)为研究对象,结合传统化学生态、分子生物学、生物信息学和电生理学技术,鉴定了绿盲蝽和苜蓿盲蝽感受性信息素和植物挥发物的气味受体基因并进行功能分析,取得的主要结果如下:1.绿盲蝽性信息素及触角电位(EAG)和行为反应昆虫性信息素的鉴定是研究利用性信息素进行防治的先决条件。本章通过气相色谱-质谱联用(GC-MS)验证了绿盲蝽雄虫与雌虫提取物中主要成分均为:4-氧代-反-2-己烯醛((E)-4-Oxo-2-hexenal)、丁酸己酯(Hexyl butyrate)和反-2-丁酸己烯酯((E)-2-Hexenyl butyrate)。通过触角电位检测出各性信息素组分及混合物均能引起绿盲蝽成虫触角的电生理反应,且雌雄虫无明显差异。在室内行为学试验中,雄性绿盲蝽对低浓度的4-氧代-反-2-己烯醛与反-2-丁酸己烯酯的混合物能产生趋向性,高能度则产生一定的驱避性;而雄性绿盲蝽对丁酸己酯有驱避反应。本研究从多个方面验证了绿盲蝽的信息素组分,为后续的嗅觉分子识别机制的研究奠定基础。2.绿盲蝽和苜蓿盲蝽触角转录组测序及气味受体基因的鉴定利用IlluminaHiSeqTM2000高通量测序平台分别对绿盲蝽和苜蓿盲蝽的触角进行转录组测序。绿盲蝽和苜蓿盲蝽雌雄虫触角测序所得碱基数均为4.6～4.8G,获得的Unigene分别为99,926个和95,262个;在所有成功比对的Unigene中,比对上最多的两个物种为赤拟谷盗(Triboliumcastaneum)和婉豆蚜(Acyrthosipho pisum)。在进行GO分类的基因中,两种盲蝽象归到嗅觉相关的结合(binding)和催化活性(catalytic activity)亚类中的基因个数均较高。通过Blastx同源搜索比对,分别在绿盲蝽和苜蓿盲蝽中鉴定得到79和68个候选OR基因;系统发育分析表明:绿盲蝽和苜蓿盲蝽的传统OR有较高的同源性;不同物种之间的非传统Orco(olfactory co-receptor)高度保守并单独聚集。利用RT-PCR的方法验证绿盲蝽序列拼接和注释的准确性,79个绿盲蝽OR基因都在触角中表达,少数OR在雄虫触角高表达,没有发现雌虫特异表达的OR。两个近缘种盲蝽象嗅觉基因的挖掘将为今后研究盲蝽象嗅觉机制提供重要参考。3.绿盲蝽性信息素受体基因的克隆、表达及功能研究本章根据绿盲蝽触角转录组预测了的3个性信息素受体(pheromonereceptor,PR)基因——AlucOR3、AlucOR2、和AlucOR42,在绿盲蝽触角中克隆得到了这3个PR基因的全长cDNA序列。组织表达谱结果显示,3个PR主要在触角中表达,其他组织的表达很少,且3个PR在雄虫触角中的表达量明显高于雌虫。时空表达结果表明AlucOR3和AlucOR42在成虫期开始大量表达,而AlucOR25在若虫和成虫各个时期均表达。进一步利用非洲爪蟾卵母细胞(Xenopus oocytes)表达并分析3个PR的功能,均对性信息素组分Hexyl butyrate和(E)-2-Hexenyl butyrate有反应,AlucOR25还对性信息素类似物有反应。剂量反应结果显示,AlucOR3对性信息素的敏感程度高于其他两个PR。本章为绿盲蝽性信息素感受机制的研究提供依据。4.绿盲蝽普通气味受体基因的鉴定、表达及功能研究嗅觉在昆虫寻找寄主过程中起到重要作用,位于嗅觉感受神经元膜上的OR在气味识别过程中有决定性作用。根据功能差异一般可以将昆虫OR分为性信息素受体PR和非性信息素受体non-PR OR。本章基于绿盲蝽触角的转录组数据,克隆得到4个普通OR全长。组织表达谱显示,4条OR在触角中高表达,在喙和足中有微量的表达,其他组织均无表达。时空生长表达谱说明这4个OR在若虫期有表达并在成虫期开始增加并高表达。进一步利用非洲爪蟾卵母细胞表达并分析4个OR的功能:其中AlucOR28能敏感地感受植物挥发物顺-3-己烯基乙酸酯,同时对其同分异构体和3种酯类化合物也有反应;AlucOR30对马鞭草烯醇有微弱反应;AlucOR12和AlucOR18对所有检测气味均无反应。研究结果为绿盲蝽普通气味受体的分子识别机制提供了依据。5.苜蓿盲蝽气味受体基因的克隆和功能研究本章基于苜蓿盲蝽触角的转录组数据的预测,克隆得到了 1个Orco基因AlinOR1、3 个 PR 基因 AlinOR4、AlinOR6 和 AlinOR7 和 2 个普通 OR 基因 AlinOR8 和 AlinOR9的全长cDNA序列。通过RT-PCR验证这6个OR都是在触角中表达。进一步利用非洲爪蟾卵母细胞表达并分析5个OR的功能:3个PR均对性信息素组分Hexyl butyrate和(E)-2-Hexenyl butyrate有反应,AlinOR4还对性信息素类似物和醇类化合物有反应,剂量反应显示对(E)-2-Hexenyl butyrate的敏感性从强到弱为A1 inOR6>AlinOR7>AlinOR4;2个普通OR中,AlinOR8对7种乙酸酯、苯环类化合物和醇类化合物有反应,AlinOR9只对苯甲醛、苯乙酮有微弱反应。研究结果为苜蓿盲蝽气味受体的分子识别机制提供了依据。综上所述,本研究从多个方面验证了绿盲蝽的信息素组分;通过触角转录组测序鉴定得到79个绿盲蝽OR和68个苜蓿盲蝽OR;在绿盲蝽触角中克隆了 3个PR和4个OR的cDNA序列,测定了这些基因的表达模式,并进一步研究了这些受体的功能;在苜蓿盲蝽触角中克隆了 3个PR和2个OR的cDNA序列,并研究了这些受体的功能。研究结果为阐明绿盲蝽、苜蓿盲蝽等盲蝽象类昆虫性信息素和植物挥发物的嗅觉识别分子机制提供了重要依据,同时为设计和开发高效的盲蝽象类行为引诱剂和交配干扰剂提供了参考。