中国樱桃SFB基因的克隆与表达研究

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中国樱桃(Prunus. pseudocerasus L.)为四倍体,原产我国,具有多个品种类型;果实虽小,但具有花期早、果实成熟早、品质优良、风味浓郁、抗寒、耐旱、耐瘠薄等诸多优良性状,是我国特有的自交亲和的四倍体李属果树种质资源。其天然具有的良好的自交亲和(SC)特性,是探讨其SC的分子基础的理想试材。研究其自交亲和的分子基础,对丰富李属植物中的多倍化植物的SC机制具有重要的理论意义,对于利用中国樱桃进行种质改良和创新具有实践意义。本研究以S基因型为S1S2S3S4的中国樱桃品种‘泰小红樱’为试材,从花粉cDNA中,克隆了花粉SFB基因,用RT-PCR方法研究了花粉中SFB基因的表达,并对‘泰小红樱’自交后代鉴定了SFB基因型,主要研究结果如下:1、根据李属SFB基因的5’端和3’端序列设计了包含起始密码子和终止密码子的引物,从花粉cDNA中克隆了4种花粉SFB基因的全长序列,在GenBank上经Blast搜索,其最大同源性基因皆为李属的SFB基因。分别命名为SFBa(1065 bp)、SFBb(1140 bp)、SFBc(1137 bp)和SFBd(1037 bp),该4个基因在GenBank的注册号分别为GQ395341(SFBa)、GQ395340(SFBb)、EU267943(SFBc)和GQ395339(SFBd)。2、SFBa、SFBb和SFBc的氨基酸序列具有李属SFB蛋白的典型的结构特征:氨基端有SFB蛋白的典型的F-box结构域,有两个可变区V1和V2,以及两个高变区HVa和HVb。因此,SFBa、SFBb和SFBc是有正常功能的花粉SFB基因。3、SFBd没有完整的开放读码框架,与其他三个正常功能的SFB基因相比,在核苷酸+19至+118位置有100 bp的缺失,导致其相应的蛋白质序列缩短。与李属正常的SFB蛋白相比,该序列推断的蛋白被截短,缺少了在N-端的、作为SFB蛋白必备的F-box结构域,但可变区V1和V2以及两个高变区HVa和HVb都存在。因此,SFBd丧失了花粉SFB基因的功能,是SFB基因无功能的突变体。4、根据SFBa、SFBb、SFBc和SFBd的序列设计四个基因的特异引物,采用RT-PCR分析了四个基因在花粉中的表达。结果表明,在花粉中SFBa、SFBb、SFBc和SFBd的表达量一致。5、包含中国樱桃SFB基因的李属SFB基因的系统进化树表明,系统发育树上缺乏基于物种的SFB基因独立聚类的分支,表明与种内SFB基因相比,李属种间的SFB基因有较高的序列相似性,反应了李属SFB基因的分歧和进化在时间上早于李属不同树种的分歧和进化。6、鉴定了‘泰小红樱’38个自交后代的SFB基因型,只有两种类型:SFBcSFBdSFBcSFBd和SFBaSFBbSFBcSFBd。且SFBcSFBdSFBcSFBd :SFBaSFBb SFBcSFBd约为1.6:1。在后代中没有检测到SFBaSFBb SFBaSFBb、SFBaSFBcSFBaSFBc、SFBbSFBcSFBbSFBc的基因型,说明含SFBaSFBb、SFBaSFBc、SFBbSFBc的花粉粒自交不亲和。所以,‘泰小红樱’上含异等位基因的花粉粒自交不亲和,即‘泰小红樱’自交亲和性不是由于二倍花粉中含有的异等位基因间的竞争性作用,而是由于非功能性的S-单元型的积累,这与酸樱桃自交亲和品种自交亲和的分子基础的结果相一致。
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