纤毛维持正常的功能需要纤毛内各种纤毛运输蛋白的协同作用,近年来对纤毛内各种运输蛋白功能的研究和报道越来越多。IFT25和IFT70(DYF-1)都是IFT-B复合物中的组分,参与纤毛内蛋白的运输,但是两者在莱茵衣藻中的研究报道较少。在莱茵衣藻中研究IFT25和IFT70(DYF-1)的功能离不开两种蛋白对应的抗体这一试验工具。本试验尝试制备IFT25和IFT70(DYF-1)的多克隆抗体,并用Western Blotting检测其特异性。首先用PCR的方法将目的基因从含有含有该基因片段的质粒中扩增出来(由于dyf-1全基因较长,只扩增出N’部分片段)分别构建到pMAL-c2X、pGEX-2T和pET-28a(+)表达载体上,最终获得六种构建好质粒pMAL-c2X-ift25、pGEX-2T-ift25、pET-28a(+)-if25 和 pMAL-c2X-dyf-1(380)、pGEX-2T-dyf-1(380)、pET-28a(+)-dyf-1(380)。将六种质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,超声波破碎,SDS-PAGE分析融合蛋白水溶性,结果为融合蛋白MBP-IFT25呈水溶性、GST-IFT25只有一部分呈水溶性、6×His-IFT25呈水不溶性、MBP-DYF-1(380)呈水溶性、GST-DYF-1(380)呈水不溶性、6×His-DYF-1(380)呈水不溶性。由于融合蛋白MBP-IFT25和MBP-DYF-1(380)呈水溶性,在非变性条件下用亲和纯化的方法进行纯化;6×His-IFT25和6×His-DYF-1(380)呈水不溶性在变性溶解条件下进行亲和纯化。结果均获得了纯度较高的融合蛋白,其中以呈水溶性的MBP-IFT25和MBP-DYF-1(380)为抗原与弗氏佐剂乳化后免疫兔子,制备多克隆抗体。加强免疫3-4次后,用ELISA测定抗血清效价,当效价超过100 000后,分离抗血清。结果第五次免疫后,两种抗血清的效价均超过了 128 000,满足试验要求。ProteinA可以特异性的结合抗血清中的所有IgG,两种抗血清经过ProteinA纯化后峰值浓度分别达到 13 mg/mL(α-IFT25)、I0mg/mL(α-DYF-1)。ProteinA纯化完的抗体再经过硝酸纤维素膜纯化法进行纯化。Western Bloting检测结果,抗体在稀释度1:1000条件下可以正确识别出莱茵衣藻中的目的蛋白。纯化的的抗体具有较高的特异性,可以用于后续试验。