论文部分内容阅读
目的:近年来研究提示,膜联蛋白（Annexin,ANXA）家族成员参与了多种重要的生物学过程,且与肿瘤的发生发展关系密切。本研究拟通过探究膜联蛋白家族成员在胰腺癌中的表达模式,建立预后模型,并探究膜联蛋白影响胰腺癌预后的潜在机制。方法:1.从癌症基因组图谱（The Cancer Gene Atlas,TCGA）下载胰腺癌患者的转录组数据和临床数据。2.从基因型-组织表达（Genotype-Tissue Expression,GTEx）下载正常胰腺组织的表达数据。3.从基因表达综合（Gene Expression Omnibus,GEO）数据库中下载胰腺肿瘤组织的基因表达以及患者的生存数据集GSE28375和GSE86916。4.使用cBioportal网站检索TCGA胰腺癌数据集中,目的基因的突变和表达情况,分析其突变、扩增,以及mRNA的表达,和对于胰腺癌患者预后的影响,生成生存率的K-M（Kaplan-Meier）曲线。5.使用GEPIA2网站中的“Survival Analysis”工具,基于TCGA胰腺癌数据集中目的基因的表达量,取中位值为cutoff值,生成K-M曲线。并用GEPIA2的表达分析功能分析来自GTEx数据库的胰腺正常组织,和来自TCGA数据库胰腺肿瘤组织中,目的基因mRNA的表达情况的差异。6.基于目的基因的表达,用LASSO（最小绝对收缩和选择算子）算法筛选出用于构建预后模型的基因,并构建预后模型。采用该模型计算风险评分,将患者分为高风险组和低风险组,对高、低风险组患者进行生存分析。用R4.0.3软件和相关软件包进行数据处理和分析。7.基于构建的预后模型,一方面,筛选出高、低风险组的差异表达基因;另一方面,分析风险评分与免疫细胞浸润程度的相关性,并筛选出显著相关的免疫细胞类型。构建差异表达基因与免疫细胞的加权基因共表达网络（Weighted Correlation Network Analysis,WGCNA）,筛选其中相关性最高的模块,使用STRING网站进行蛋白互作网络（Protein-Protein Interaction Networks,PPI）分析,并使用“Cytoscape”软件查找核心基因。8.基于构建的预后模型,分析风险评分与免疫检查点相关基因表达的相关性。9.构建敲减目的基因的胰腺癌细胞系,用MTT（四唑盐）比色法检测细胞体外增殖能力;用Transwell侵袭实验评价细胞在体外的侵袭能力;建立皮下移植瘤模型,并测定肿瘤的体积和重量。10.GEO数据库中下载敲除目的基因的小鼠胰腺癌样本的表达谱数据集（GSE62285）,预测目的基因的下游基因。11.在TCGA胰腺癌数据集中,用Pearson相关性分析寻找与目的基因存在共表达关系的基因,并富集相关通路。结果:1.胰腺癌中ANXA家族的基因改变事件中,扩增和mRNA过表达更为常见,ANXA家族的基因突变情况与患者预后无相关性,而存在ANXA家族基因扩增的患者,相比无基因扩增的患者,总生存期（Overall Survival,OS）显著缩短（P=0.017）。2.除ANXA9外,其余ANXA家族成员在胰腺肿瘤组织中表达上调（*P＜0.05）。单因素Cox回归分析得到与预后相关的9个基因（ANXA1/2/3/4/5/6/8/10/11）,其中ANXA2与胰腺癌患者的预后不良相关性最显著。采用LASSO回归算法构建预后模型,筛选出4个基因（ANXA1/2/3/6）,计算风险评分,并根据风险评分的中位值确定高、低风险人群。结果显示,高风险组相较于低风险组,总生存期（OS）显著缩短（P=2.882e-3）,ROC曲线显示风险评分的可靠性（AUC=0.694）。我们使用GEO数据库的外部验证集（GSE28375+GSE86916）进行验证,高风险组患者的预后同样比低风险组差,P值接近统计学意义（P=0.05519）。ROC曲线显示,该风险评分同样可预测验证集中胰腺癌患者的3年生存率（AUC=0.795）。3.探讨该预后模型与肿瘤微环境的关系,发现B细胞、浆细胞、CD8+T细胞、激活的CD4+记忆T细胞的浸润水平与风险评分呈负相关,而M0巨噬细胞的浸润水平与风险评分呈正相关。我们寻找该预后模型中高风险组和低风险组的差异表达基因,并通过加权共表达分析（WGCNA）确定核心基因（CD19和MS4A1）。免疫检查点相关基因LAG3、CTLA4、ICOS等25个基因在低风险组的患者胰腺癌组织中表达较高,CD70、TNFSF9、TNFSF14等7个基因在高风险组的患者胰腺癌组织中表达较高。4.敲减ANXA2后PANC-1胰腺癌细胞的增殖能力明显减弱;Transwell侵袭实验表明,干扰ANXA2抑制胰腺癌细胞的侵袭。裸鼠移植瘤模型显示,敲减ANXA2能够显著抑制胰腺癌移植瘤的生长。5.在GSE62285数据集中,敲除ANXA2后,小鼠胰腺癌细胞中有24个基因表达上调,65个基因表达下调,提示这89个基因可能是ANXA2的下游基因。这89个基因中,61个能够在人类基因组中找到对应的基因。6.ANXA2下游基因中,15个基因与ANXA2在TCGA胰腺癌数据集中存在共表达关系。存在共表达关系的15个基因中,ABCC3、ENPP2、ITGB6、SERPINB5、SLC39A4与胰腺癌患者的预后显著相关。7.根据 ABCC3、ENPP2、ITGB6、SERPINB5、SLC39A4 的表达水平,将 TCGA胰腺癌数据集中的样本分为高、低表达组,并进行KEGG富集分析,确定了显著富集的相关通路,其中包括与肿瘤生长、转移密切相关的诸多信号通路。结论:1.本研究基于ANXA家族表达情况所构建的预后模型,可用于识别胰腺癌中的高危患者,该预后模型与肿瘤微环境中的免疫细胞密切相关。2.本研究发现,ANXA2促进胰腺癌生长转移,并探讨了 ANXA2的下游信号转导机制,为进一步研究ANXA家族成员作为胰腺癌预后指标及影响预后的潜在机制提供了基础。