基于DNA-纳米粒子复合物的光谱分析方法的研发及应用

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纳米材料可提供无限的组分、尺寸、维度和形貌的组合,进而偶联不同的探针分子,制备不同性质的纳米探针。核酸包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA),在生理环境下,特定的酶可以将核酸水解为片段。核酸分子探针因具有稳定、易于修饰、序列多变及识别多元化等优点,可通过非共价/共价结合的方式固定在纳米粒子表面形成“核酸-纳米粒子”复合物,构建基于核酸纳米探针的传感平台应用于生物分析及生物医学等领域。制备核酸纳米探针的纳米材料中,金纳米粒子(gold nanoparticles,AuNPs)具有较高的摩尔消光系数,大的比表面积,与粒子形状、大小、聚集程度以及粒子之间距离相关的光学性质等特点,并且其既可与氨基发生非共价的静电吸附作用,又可与巯基形成很强的共价键,可制备DNA-AuNP复合物探针,利用AuNPs特殊的颜色效应,结合DNA探针的特异性和信号传导机制,设计一系列生化反应以改变AuNPs间的距离,实现对靶标物质简单、快速、高灵敏度的检测,并应用于实际样品检测。此外,聚多巴胺纳米粒子(polydopamine nanoparticles,PDA NPs)作为一种新型的纳米材料,因具有独特的物理/化学性质,良好的生物相容性和生物可降解性等特点,而被广泛地应用于纳米材料的表面修饰,生物/电化学传感器的构建以及金属离子的富集等诸多领域。特别是,PDA NPs因其独特的共轭体系,可与单链DNA分子通过π-π非共价作用力结合,并高效淬灭寡核苷酸上标记的荧光染料或荧光纳米粒子的荧光信号,构建基于DNA-PDA NP复合物的荧光传感平台,实现对靶标物质简单、快速的检测,并能应用于体内荧光成像。结合纳米材料的独特性质和核酸分子探针的优点,本文发展了一系列基于DNA-AuNP和DNA-PDA NP复合物探针的光谱分析方法并应用于汞离子、腺苷、活性氧、微小核糖核酸及细胞色素C的检测。  1.发展了一种基于适配体无标记AuNPs的动态光散射法检测溶液中的汞离子。汞离子适配体通过静电作用吸附在AuNPs表面,在较高的离子强度下,通过考察汞离子存在时AuNPs的水合粒径变化值检测汞离子的浓度。实验结果表明,本方法具有较高的灵敏度(检出限为0.1 nM)和较好的选择性;此外,湖水及矿泉水两种水样加标实验结果与传统的电感耦合等离子体质谱法所测数据有很好的一致性,证明本方法能够用于实际水样中汞离子的检测。  2.构建了基于AuNPs和核酸外切酶Ⅲ(ExoⅢ)辅助循环信号放大的比色传感器用于检测腺苷。将两种巯基修饰的单链DNA修饰到AuNPs表面,在带有腺苷适配体序列的探针诱导下,适配体与单链DNA互补杂交导致AuNPs发生团聚,溶液显蓝色;当腺苷存在时,腺苷会与其核酸适配体结合,导致部分AuNPs解聚;同时,ExoⅢ可水解腺苷与其适配体形成的双链结构,促使腺苷释放出来,再次与其它腺苷适配体发生特异性识别,少量的腺苷目标分子能够促使大量的适配体探针降解释放出来,最终导致与适配体探针交联的AuNPs数目减少,AuNPs的聚集程度逐渐降低,溶液颜色恢复为红色。与没有ExoⅢ辅助信号放大的传感器相比,该传感器的灵敏度提高了10倍。同时,该传感器还可检测实际样品中的腺苷。  3.利用荧光共振能量转移原理,发展了一种基于PDA NP-DNA复合物检测活性氧的分析方法。荧光标记的单链DNA通过π-π堆积作用吸附在PDA NPs表面,荧光信号被PDA NPs淬灭;在活性氧自由基的作用下,DNA氧化断裂为片段,荧光分子从PDA NPs表面解离,荧光信号得以恢复。通过考察荧光信号的变化值或利用激光共聚焦成像技术检测溶液中和细胞中的活性氧。此外,对不同抗氧化剂存在下体系的荧光强度变化情况的研究结果表明,不同的抗氧化剂抑制DNA断裂的效率有显著差异。因此,该方法还可应用于体外筛选具有抗氧化类成分的天然或人工合成药物等研究领域。  4.利用PDA NPs对荧光标记的核酸探针的淬灭效应,以及脱氧核糖核酸酶Ⅰ(DNaseⅠ)能够选择性的剪切DNA/RNA杂合结构中单链DNA的特性,发展了一种新型等温信号放大法检测微小核糖核酸(microRNA,miRNA)。miRNA与DNA形成双螺旋结构,使DNA从PDA NPs表面解离,DNaseⅠ不会降解双螺旋结构中的miRNA从而使其被释放出来,可再次进行与DNA杂交、DNaseⅠ酶切等反应,如此循环反复,可实现恒温条件下一个miRNA分子与多个探针杂交、酶切、释放荧光基团的循环过程,最终体系的荧光信号得到显著放大。该方法具有简单、快速、低成本、高选择性和高灵敏度的特点,并且能够满足实际样品中miRNA的检测要求。  5.采用反相微乳液法合成了一种PDA包裹上转换纳米粒子(UCNP)的核壳结构纳米粒子(UCNP@PDA),氨基修饰的DNA通过迈克尔加成反应或席夫碱反应连接到UCNP@PDA表面,荧光分子Cy3修饰的细胞色素C核酸适配体(Cy3-aptamer)与氨基DNA互补杂交后形成UCNP@PDA-DNA@aptamer纳米复合物探针。此时,由于Cy3与PDA NPs之间发生了荧光共振能量转移过程,Cy3的荧光被淬灭;当有细胞色素C存在时,细胞色素C与其核酸适配体特异性结合,使得Cy3脱离PDA NPs表面,荧光信号得以恢复。荧光光谱分析和激光共聚焦成像结果表明,随着细胞内细胞色素C的增加,体系的荧光信号逐渐增强。此外,包裹的UCNP因具有良好的光学稳定性且没有背景荧光的干扰,不但可作为一种有效的纳米探针用于上转换荧光成像,其上转换荧光光谱还可作为内标半定量细胞色素C。
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