论文部分内容阅读
目的：产碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌在世界各地的爆发威胁着人类的生命健康，而且携带KPC的细菌感染与高死亡率呈正相关。因此及时准确快速的检出产KPC细菌对预防、控制耐药菌株的流行意义重大。推荐的改良Hodge试验准确性高，但较费时。PCR扩增检测时间大大缩短，但对仪器设备和场所要求较高。核酸序列依赖性扩增NASBA具有操作简便、扩增效率高、特异性强的优点。本研究旨在建立检测KPC耐药的NASBA检测方法，并对该方法进行初步评价。方法：本实验采用依赖KPC转录产物mRNA的NASBA扩增检测KPC耐药。根据Genebank中肺炎克雷伯菌管家基因MDH的保守序列、肠杆菌科细菌耐药基因KPC的保守序列设计NASBA引物，将上述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳及测序鉴定。同时摸索及优化NASBA反应中各酶浓度、离子浓度、反应温度等条件，分析该方法的灵敏度和特异性。采用该NASBA方法、PCR及逆转录PCR检测临床收集的45株肺炎克雷伯菌，比较结果的一致性。结果：KPC及MDH的NASBA扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分别得到249nt、190nt的特异性条带，并且测序鉴定序列与预计片段序列比对一致。通过摸索及优化NASBA反应中各酶浓度、离子浓度、反应温度等条件建立NASBA扩增体系（24μl）：缓冲液中氯化钾终浓度60mmol/L，氯化镁终浓度14mmol/L，PH8.0Tris-HCl终浓度40mmol/L，DTT终浓度7.5mmol/L，DMSO终浓度15%；每个引物终浓度0.2μmol/L；dNTP1mmol/L；NTP2mmol/L；酶混合液中T7RNA聚合酶50U、AMV逆转录酶10U、RNase H0.5U、BSA0.1mg/ml；反应温度：40℃；反应时间：90min。该NASBA方法能检测到10-3ng/μl的RNA量，较RT-PCR方法多2个数量级，提示该方法比RT-PCR灵敏度高；对照KPC阴性菌株与KPC阳性菌株的NASBA扩增产物电泳分析发现仅KPC阳性菌株出现特异性条带。45株临床收集的肺炎克雷伯菌中32株NASBA扩增阳性，13株NASBA扩增阴性，与药敏、PCR、RT-PCR结果一致，符合率达到100%。结论：NASBA方法检测KPC型碳青霉烯酶耐药简便快速，并且灵敏度和特异性均较高，具有广阔的应用前景。