Ghrelin是kojima等于1999年首先发现的一种生长激素促分泌激素受体(GHS-R)的天然内源性配体，Ghrelin在机体内作用广泛，能促进GH的分泌、增强食欲、调节能量负平衡、增强机体免疫力与抗应激能力等。　　胸腺上皮细胞是胸腺基质细胞中数量最多，分布最广的一种，也是胸腺微环境最重要的组成部分，为阐明Ghrelin对小鼠胸腺上皮细胞(MTEC)的作用，揭示Ghrelin促胸腺作用的机理，本实验分为5个部分，从不同层面阐述了Ghrelin调节MTEC细胞功能的机理，具体实验内容如下：　　1.MTEC细胞的分离、培养和鉴定本章根据文献报道的一些方法，加以综合改良后成功的分离、培养了MTEC细胞，并经培养生长特性，形态学和HE染色观察、免疫组化等方法进行了鉴定。结果证实本研究室分离的小鼠胸腺上皮细胞活力好、功能正常、代谢旺盛，能在普通DMEM中良好生长并持续传代。　　2.MTEC细胞中Ghrelin及其受体GHS-R表达分析本部分实验分析了培养的MTEC细胞中Ghrelin及其受体GHS－R的表达情况。RT-PCR结果显示Ghrelin及其受体GHS－R基因在培养的MTEC细胞都有转录；免疫荧光结果显示在体外培养的MTEC细胞中GHS－R1a阳性表达。Western-blot分析结果证实MTEC细胞中有Ghrelin前体和GHS-R1a蛋白表达；ELISA检测表明体外培养的MTEC细胞能分泌Ghrelin，其24h、48h培养上清液中Ghrelin平均浓度分别为39.20 pg/mL、29.29 pg/mL。　　3.Ghrelin对MTEC细胞增殖的影响本部分实验采用WST-8 kit、中性红法、流式细胞术和荧光定量PCR的方法检测了不同浓度的外源性Ghrelin对MTEC细胞增殖的影响。WST-8 kit和中性红法检测显示：与对照组相比，10-6～10-9M浓度范围的Ghrelin不同处理时间组对MTEC的增殖都有促进作用，其中10-7M的Ghrelin在处理MTEC细胞36h时有最佳的促增殖效应。　　与对照组相比，其中10-7M Ghrelin24h、36h处理组的促增殖数分别达到了1.439倍、2.022倍；10-8M Ghrelin24h、36h处理组的促增殖数分别达到了1.526倍、1.654倍；其促增殖效应均有统计学意义(P<0.05)。　　经中性红法(NR)检测了8个不同浓度的Ghrelin处理MTEC细胞36h，其中与对照组相比，2.5×10-7、1.25×10-7、6.25×10-8、3.13×10-8、1.57×10-8、7.8×10-9M Ghrelin36h处理组的净增殖率分别为0.378、0.881、0.706、0.564、0.453、0.138，其促增殖效应均有统计学意义(P<0.05)。　　流式细胞术检测用10-7 mol/L Ghrelin分别处理24h、36h、48h的MTEC细胞发现，Ghrelin是通过缩短G0/G1期，促进S期而促进MTEC细胞增殖的；荧光定量PCR检测结果表明：与对照组相比，Ghrelin能增强细胞周期促进基因E2F3、C-myc、CyclinE、CDK2、CyclinD1、CDK4、H-Ras mRNA的表达，且对E2F3、C-myc、CyclinE、CDK24种基因表达的促进作用具有统计学意义(P<0.05)，Ghrelin同时也能抑制细胞周期抑制基因SCF的表达(P<0.05)，因此Ghrelin能从正反两个方面促进MTEC细胞的增殖(见第四章SCF基因)。　　4.Ghrelin对MTEC细胞部分功能基因的影响本章采用RT-PCR、Western-blot和ELISA检测了不同浓度、作用时间的Ghrelin处理MTEC细胞，对其部分功能基因的影响。荧光定量PCR结果显示：与对照组相比，10-7 MGhrelin36h处理组FGF-R2、Ghrelin、GHSR、SCF、IL-6基因的mRNA表达量都有所下降，其中FGF-R2、Ghrelin、SCF、IL-6基因的mRNA表达量下降具有统计学意义(P<0.05)；β2-MG、IL-7、TGF、MTHFD2L(THF)、THY、LIF基因的mRNA表达量都有所上升，其中只有TGF表达量的上升具有统计学意义(P<0.05)。Western-blot分析表明：与对照组相比，10-6MGhrelin48h处理组GHS-R1a、β2-MG、TMPO(THY)和TGF蛋白的表达都明显增加；而10-7M Glarelin48h处理组TMPO(THY)和TGF蛋白的表达也明显增加，但对GHS-R1a、β2-MG蛋白表达的影响不明显。ELISA法检测MTEC细胞上清液中IL-6的结果显示：MTEC细胞上清液中IL-6的本底表达量较高，分别添加10-6M、10-7MGhrelin对MTEC细胞处理24h、36h、48h、60h对其IL-6蛋白的表达影响不明显。　　5.Ghrelin真核表达质粒的构建及其对MTEC细胞的转染本章参照文献构建、克隆了pcDNA3.1-ghrelin真核表达质粒并转染MTCE细胞，用荧光定量PCR、ELISA的方法测定了转染pcDNA3.1-ghrelin质粒对MTCE细胞部分功能基因的影响。　　荧光定量PCR结果显示：与对照组相比，实验组MTCE细胞转染pcDNA3.1-ghrelin真核表达质粒36h后，Ghrelin基因mRNA的表达量升高9173.99倍、IL-6mRNA表达量降低为0.82倍，二者与对照组的差异都有统计学意义(P<0.05)。　　ELISA检测结果显示：实验组MTEC细胞转染pcDNA3.1-ghrelin质粒24h、36h后上清液中Ghrelin的平均含量分别为131.33pg/mL、86.17pg/mL，而pcDNA3.1(+)空质粒转染对照组分别为27.18 pg/mL、24.57pg/mL，无转染MTEC细胞24h、48h培养上清液分别为39.20 pg/mL、29.29pg/mL。实验组MTEC细胞转染pcDNA3.1-ghrelin质粒24h、36h后上清液中IL-6的平均含量分别为240.55pg/mL、276.53pg/mL，而pcDNA3.1(+)空质粒转染对照组分别为231.51 pg/mL、298.79pg/mL，无转染MTEC细胞24h、36h培养上清液分别为225.29 pg/mL、288.34pg/mL。　　以上结果证实本实验所构建的pcDNA3.1-ghrelin真核表达质粒及其对MTEC细胞的转染是成功的。