论文部分内容阅读
TET蛋白是一种重要的羟甲基化酶,包括TET1、TET2和TET3,它可以催化5-甲基胞嘧啶(5-methyl-cytosine,5mC)形成5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethyl-cytosine,5hmC)。TET蛋白在肿瘤等疾病的发生和发展过程中起着重要的作用。目前,TET2和TET3被广泛的认为是一种抑癌基因,但对于TET1的作用存在争议。基因突变是肿瘤发生的重要原因,TET蛋白家族在肿瘤中已发现多个基因突变位点,尤其是TET2的突变频率较高,有关TET1突变的报道很少,目前为止TET3的突变报道也仅有一例。研究TET蛋白家族在肿瘤中的突变对分析TET影响该肿瘤发生的机制有重要意义。对临床样本25例食管癌组织和25例癌旁组织进行DNA提取,之后进行TET突变位点的筛选,对于筛选出的突变位点在食管癌细胞系中验证。对临床样本25例食管癌组织和25例癌旁组织进行RNA提取,利用荧光定量PCR技术检测TET在食管癌中的表达情况,进一步结合TCGA数据库对TET1与食管癌的相关性进行临床数据分析。利用位点特异性变异技术对TET1质粒进行定点突变,将野生型和突变型的TET1质粒转染到HEK293细胞中,通过Dot blot检测5hmC的表达量,通过Western blot检测TET1蛋白的表达量。将野生型和突变型的TET1质粒转染到EC109细胞中,通过MTT细胞增殖实验、细胞划痕实验、Transwell实验来探究此突变对于EC109细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。通过研究我们发现了一种关于TET1的高频错义突变,对应在mRNA上的突变位置及变化为3874 A→G,对应在蛋白上的位置及变化为1123I→M,且在食管癌细胞系中也存在此突变。RT-PCR结果显示与癌旁组织相比,在食管癌组织中TET1、2、3均低表达;与正常食管细胞相比,在食管癌细胞系中TET1低表达。Dot blot和Western blot结果显示1123突变对TET1的羟甲基化功能和蛋白的表达情况无明显影响,但此突变对细胞增殖、侵袭能力有一定的影响。转染TET1及1123突变质粒对EC109细胞增殖和侵袭能力的抑制作用有显著性差异,RT-PCR结果提示转染1123突变质粒引起的EC109细胞增殖和侵袭能力下降增强可能与GLUT1、MTA2基因表达下调相关,为食管癌的早期鉴定提供了新的思路。