邻单胞菌M6甲基对硫磷水解酶催化特性的研究

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甲基对硫磷水解酶(MPH)是一种新的有机磷水解酶。本研究将完整的甲基对硫磷水解酶基因(mpd)构建入pUC19载体,使得mpd基因以自身的启动子在Escherichia coli DH5 α中表达并通过DEAE-Sephadex,Bio-Gel P30和CM-Sepharose柱进行了纯化并得到了纯酶,测得该酶水解甲基对硫磷的动力学参数kcat和kcat/Km值分别为175s-1和9.8×104M-1s-1。金属螯合实验发现MPH的活性不受金属螯合剂EDTA和1,10-菲啰啉的影响;但用电感耦合等离子发射光谱测定金属含量发现MPH是金属酶,1mol酶中结合了2mol的Zn2+。为确定参与MPH催化所必需的氨基酸,用化学修饰剂碳化二亚胺、二乙基焦磷酸酯、吡哆醛和丁二酮分别处理MPH,然后检测其残余酶活力,结果表明碳化二亚胺、吡哆醛和丁二酮不能抑制酶的活性,所以天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸和精氨酸残基与酶的催化活性无关;然而二乙基焦磷酸酯对组氨酸侧链的化学修饰引起酶活性的大幅度的下降,其对酶活性的抑制率达到9.6h-1,当在酶的抑制体系中加了羟胺后,MPH的酶活力能够恢复到原来的60%。这些结果表明组氨酸是酶活力所必需的基团,被二乙基焦磷酸酯修饰的MPH在245nm处出现吸光值的升高进一步说明了组氨酸残基被二乙基焦磷酸酯修饰。与对硫磷水解酶(OPH)催化机理不同的是,利用原始酶和突变酶以甲基对硫磷为底物时的Vmax对pH作图发现有两个解离基团为酶催化活性所必需的。将MPH中的八个组氨酸通过定点突变的方法分别突变为天冬酰胺发现至少有五个组氨酸参与了酶的催化反应,这些突变导致了一些突变子pKa值的大幅度变化。通过该方法同样得到了另外两个突变子S301A和274V,这两个突变子对甲基对硫磷的动力学参数测定结果表明Ser301和Asp274对酶的催化活性非常重要。同时,利用三唑磷农药为底物,筛选了针对底物三唑磷的MPH突变体。总共得到了5个突变体,其中M5对三唑磷的kcat和kcat/Km值分别比原始酶提高了85倍和200倍。这些结果表明MPH与来自pseudomonas diminuta的对硫磷水解酶(OPH)不同;体外的蛋白工程技术能够被用来增强酶的活性和扩大酶利用底物的范围。
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