2型糖尿病（Type 2 diabetes）是一类以高血糖为特征的慢性代谢疾病,其基本病理生理机制包括胰岛素抵抗、胰岛功能逐步损伤或衰竭。在代谢负荷过高（如糖脂过剩）、胰岛素抵抗或慢性炎症等因素的持续作用下,胰岛β细胞内活性氧（ROS）大量产生,并出现氧化应激（Oxidative stress）、内质网应激（ER stress）等细胞应激,而这些细胞应激会导致细胞功能损伤。但同时细胞内也伴随各种适应性反应发生,细胞应激与适应性反应的平衡决定胰岛β细胞的命运。当胰岛β细胞的损伤与细胞内的适应性反应失衡时,会导致细胞功能出现障碍,甚至发生细胞坏死或凋亡,最终导致2型糖尿病的发生。在应激所致的细胞凋亡中,常伴随c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）的活化。JNK被应激反应所激活,活化的JNK通过调控下游分子参与细胞内多种信号途径,并与多种疾病,如糖尿病的发生发展密切相关。本实验室前期研究发现,过氧化氢（hydrogen peroxide,H2O2,氧化应激诱导剂）和毒胡萝卜素（Thapsigargin,TG,内质网应激诱导剂）处理胰岛β细胞一定时间后,会导致细胞凋亡发生并伴有JNK活化水平升高。NR4A1（Nuclear receptor subfamily 4 group A）是一种应激反应因子,作为转录因子发挥作用,即通过促进相关基因的转录水平而参与细胞多种生命活动的调控。本实验室前期研究发现,在遭受氧化应激或内质网应激的胰岛β细胞中,应激反应因子NR4A1表达升高,并且NR4A1通过调控抗凋亡分子或抗氧化分子以抵抗胰岛β细胞凋亡。但在这一过程中,NR4A1是否能调控JNK的活化及相应的机制都不不清楚。因此本论文旨在研究在胰岛β细胞中NR4A1对氧化应激或内质网应激所致JNK活化的调控作用,以寻找NR4A1对胰岛β细胞保护的新机制。本研究发现,NR4A1可降低氧化应激及内质网应激所致的JNK活化及胰岛β细胞凋亡,并且NR4A1通过两条途径下调JNK活化水平:NR4A1可增强cbl-b（泛素连接酶3）的转录水平以降解MKK4（JNK激酶）蛋白,最终减少JNK活化;NR4A1也可增强MKP7（又称Dusp16,JNK磷酸酶）的转录水平,以增强活化形式JNK（p-JNK）的去磷酸化,最终减少p-JNK的水平。本论文的研究内容分为以下三个部分:第一部分应激状态下NR4A1可负性调控JNK活化以保护胰岛β细胞[目的]利用NR4A1-KO鼠及MIN6细胞株,检测在氧化应激或内质网应激状态下NR4A1对胰岛β细胞凋亡及JNK活化的影响,并初步探索NR4A1对JNK活化的调控机制。[方法]1.利用CRISPR/Cas9技术构建NR4A1全身敲除鼠,PCR实验鉴定小鼠基因型,以及蛋白免疫印迹（Westernblot）实验检测小鼠胰岛内NR4A1的水平。2.对高脂饲养的NR4A1-KO鼠及WT鼠进行代谢表型检测,包括空腹血糖及血清中胰岛素含量等。3.提取高脂饲养的NR4A1-KO鼠及WT鼠的胰岛及胰腺,用光镜及免疫荧光实验观察胰岛的改变及胰岛内细胞比率的改变;TUNEL实验检测细胞凋亡情况。4.提取高脂饲养的NR4A1-KO鼠及WT鼠的胰岛,Western blot实验检测胰岛中p-JNK水平。5.用慢病毒感染MIN6细胞系,以构建过表达NR4A1的OV细胞及对照NC细胞,用Western blot实验鉴定NR4A1表达水平。6.用H2O2或TG处理OV及NC细胞以诱导细胞发生氧化应激或内质网应激,用CCK8实验检测两种应激状态下过表达NR4A1对胰岛β细胞存活的影响;用Western blot实验检测应激状态下过表达NR4A1对胰岛β细胞凋亡及JNK活化的影响。7.用JNK抑制剂SP600125联合H2O2或TG处理MIN6细胞,用Western blot实验验证胰岛β细胞内JNK活化水平与细胞凋亡的关联。[结果]1.PCR以及Western blot实验证实,本研究使用的NR4A1-KO鼠为NR4A1基因敲除的纯合体小鼠。2.经高脂饲养后,NR4A1-KO鼠的空腹血糖水平较高,呈现一定程度的胰岛β细胞功能受损,即胰岛素分泌相对减少。3.光镜下及免疫荧光实验显示,NR4A1-KO鼠经高脂饲养后,大胰岛数量增多,胰岛内β细胞比例增大;TUNEL实验显示,NR4A1-KO鼠经高脂饲养后,胰岛内细胞凋亡发生增多。4.Western blot实验显示,NR4A1-KO鼠经高脂饲养后,胰岛组织中JNK活化水平显著升高。5.成功构建稳定过表达NR4A1的胰岛β细胞系,即OV细胞。6.CCK8实验显示,在H2O2或TG处理下,与NC细胞相比,OV细胞存活率显著升高;Western blot实验显示,在H2O2或TG处理下,与NC细胞相比,OV细胞中Cleaved Caspase-3水平及JNK活化水平（p-JNK水平）显著降低,但JNK总蛋白量无显著差异。7.Western blot实验显示,经SP600125处理后,MIN6细胞内H2O2或TG所致的JNK活化被抑制,且Cleaved Caspase-3水平降低。[结论]1.高脂饮食下,NR4A1-KO鼠胰岛功能受损,胰岛内细胞凋亡增多、JNK活化水平升高。2.NR4A1可降低细胞应激所致的JNK活化及胰岛β细胞凋亡发生。3.NR4A1下调JNK活化水平,但不影响JNK总量或表达。第二部分NR4A1通过上调cbl-b表达以减弱细胞应激所致JNK活化[目的]从激活JNK的上游激酶MKK4及MKK7切入,探讨NR4A1负性调控JNK活化的相关机制。[方法]1.使用H2O2或TG处理OV及NC细胞,用qPCR及Western blot实验检测NR4A1对JNK上游激酶MKK4、MKK7表达的影响。2.向OV及NC细胞中共转染Flag-MKK4、HA-Ub质粒,通过免疫沉淀实验检测细胞中MKK4分子的泛素化水平。3.使用蛋白酶体抑制剂MG132处理OV及NC细胞,用Western blot实验检测过表达NR4A1是否增强MKK4蛋白的泛素化降解。4.使用H2O2或TG处理OV及NC细胞,用qPCR及Western blot实验检测NR4A1对cbl-b（泛素连接酶3）表达的影响。5.在OV细胞中感染靶向cbl-b的shRNA慢病毒或对照病毒,构建稳定敲低cbl-b 的 KD-cblb 细胞或对照 CON-cblb 细胞;H2O2或 TG 处理 KD-cblb 及 CON-cblb细胞,用Western blot实验检测敲低cbl-b后,JNK活化水平的改变。6.构建四个不同长度的cbl-b启动子质粒,与TK质粒共转染至NC及OV细胞,用双荧光素酶报告基因实验检测NR4A1能否增强cbl-b不同长度启动子的转录活性。7.用Ad-NR4A1-HA腺病毒或对照Ad-GFP腺病毒感染MIN6细胞,并在预测结合位点处设计引物,用染色质免疫沉淀（ChIP）实验检测NR4A1与cbl-b启动子上的预测结合序列是否具有物理结合。8.提取高脂饲养的NR4A1-KO鼠及WT鼠胰岛或胰腺,qPCR、免疫印迹实验及免疫荧光染色实验检测NR4A1缺失对cbl-b表达的影响。[结果]1.Western blot实验显示,NR4A1可降低MKK4蛋白水平;qPCR实验结果显示,MKK4的RNA表达水平在两种细胞中无显著差异。2.Western blot实验显示,NR4A1可增强MKK4的泛素化水平。3.Western blot实验显示,MG132可阻断MKK4蛋白的降解。4.QPCR及Western blot实验显示,NR4A1可增强cbl-b表达水平。5.Western blot实验显示,已成功构建敲低cbl-b表达的KD-cblb细胞;cbl-b表达降低后,MKK4蛋白水平显著升高;经H2O2或TG处理后,KD-cblb细胞中JNK活化水平显著升高。6.双荧光素酶报告基因实验显示,NR4A1可增强cbl-b不同长度启动子的转录活性,并且在-499bp至-14bp区间的增强作用最为显著。7.ChIP实验显示,NR4A1可与cbl-b启动子上-198bp处预测的结合位点有物理结合。8.QPCR、Western blot实验及免疫荧光实验显示,与WT鼠相比,NR4A1-KO鼠的胰岛组织中cbl-b表达量显著降低。[结论]1.NR4A1通过负性调控MKK4表达来减少JNK活化。2.NR4A1增强cbl-b（泛素连接酶3）的表达水平。3.cbl-b泛素化降解MKK4蛋白。4.NR4A1可以上调cbl-b基因启动子的转录水平,并与其有物理结合。第三部分NR4A1通过上调MKP7表达以减弱细胞应激所致JNK活化[目的]本部分将从p-JNK的磷酸酶MKPs入手,探究NR4A1负调控JNK活化的另一个可能的机制。[方法]1.用H2O2或TG处理OV及NC细胞,qPCR及Western blot实验检测NR4A1对靶向p-JNK的磷酸酶MKP2及MKP7的影响。2.使用靶向MKP7的shRNA慢病毒或其对照病毒感染β-TC6细胞（胰岛β细胞）,构建敲低MKP7的KD-MKP7细胞及对照CON-MKP7细胞;H2O2及TG处理细胞后,用Western blot实验检测MKP7敲低后JNK活化水平的变化。3.构建三种不同长度Mkp7启动子质粒,分别与TK质粒共转染到NC及OV细胞,双荧光素酶报告基因实验检测NR4A1能否增强Mkp7不同长度启动子的转录水平。4.用Ad-NR4A1-HA腺病毒或对照Ad-GFP腺病毒感染β-TC6细胞,并在预测的两个结合位点处设计引物,ChIP实验检测NR4A1与Mkp7启动子上的预测结合位点是否具有物理结合。5.提取高脂饲养的NR4A1-KO鼠及WT鼠胰岛,qPCR及Western blot实验检测NR4A1缺失对MKP7水平的影响。[结果]1.QPCR及Western blot实验显示,NR4A1可增强p-JNK的磷酸酶MKP7水平;经H2O2或TG处理后,OV细胞中MKP7的蛋白水平也仍保持较高水平。2.经Western blot实验鉴定,KD-MKP7细胞中MKP7水平显著降低;经H2O2或TG处理后,KD-MKP7细胞中JNK活化水平显著升高。3.双荧光素酶报告基因实验显示,NR4A1可增强Mkp7启动子转录活性,并且在-500bp至0bp区间及-2000bp至0bp区间的增强作用最为显著。4.ChIP实验结果显示,NR4A1与Mkp7启动子上-55bp及-1637bp的预测结合位点具有物理结合。5.QPCR及Western blot实验结果显示,NR4A1-KO鼠胰岛组织中MKP7的水平显著降低。[结论]1.NR4A1可通过增强磷酸酶MKP7的表达,进而增强活化JNK（p-JNK）的去磷酸化水平。2.NR4A1可上调Mkp7启动子的转录活性,并与预测的两个结合位点均有物理结合。