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新抗生素的发现速度减缓、多重耐药菌的日益严重等一系列威胁农业生产与人类生命健康的问题正愈加突出,如何有效地获得新型天然药物是天然产物领域的研究热点。微生物次级代谢产物因其新颖的结构和广泛的生物活性,一直是新药研发的主要来源之一。其中,栖息于海洋等特殊生境的放线菌,因特殊的气候、地质和营养条件,蕴育着独特的代谢机制,正逐渐成为药用菌种资源开发的“新生力量”。建立一套科学有效的挖掘策略,不仅能推动对这些潜在药用菌种资源的开发,也能为发掘新颖活性产物提供新的思路。本研究以寻找新的活性次级代谢产物为出发点,对多种生境来源的放线菌进行了分离和筛选,通过活性测试结合基因组分析优选了一株海洋稀有放线菌糖丝菌Saccharothrix sp.D09,对其进行了深入、系统地产物挖掘;此外,还鉴定了芽孢杆菌中一类具有良好生物活性的新型三联噻唑化合物的结构及生物合成途径,主要的研究内容和结论如下:（1）多种生境来源的放线菌的分离及其次级代谢产物合成潜力初步评价采用经典的放线菌稀释平板分离法,本研究从海洋沉积物、海洋动物、苔藓、植物叶片和根际等生境来源的8份样品中分离到了 171株放线菌,优势菌属为链霉菌属,共有92株,剩余的为稀有放线菌,共有76株,占总数的44.4%,分布于 26 个属。通过 OSMAC（One Strain Many Compounds）策略初步评价了它们的次级代谢产物合成潜能,有21株放线菌能产生较为丰富的代谢产物。根据活性和化学追踪,对其中4株菌进行了产物分离,获得了 lobophorin A和chrolactomycin,均为已知化合物。但进一步的基因组分析表明,它们拥有丰富的新颖生物合成基因簇。这些结果一方面说明了这些生境的放线菌仍有较大的生物合成潜力有待挖掘,也说明了传统的提取分离方法的局限性。因此,需要更加高效的挖掘策略来研究它们的次级代谢产物。（2）利用“OSMAC-基因组-转录组”策略挖掘海洋稀有放线菌Saccharothrix sp.D09的次级代谢产物海洋来源的稀有放线菌Saccharothrix sp.D09能产生大量有良好抗菌活性的代谢产物。对该菌进行全基因组测序和分析,发现其含有41个新颖的次级代谢产物生物合成基因簇。说明D09有产生新颖产物的巨大潜力,值得优先研究。本部分建立了一种将OSMAC、基因组、转录组分析挖掘三者有机结合的挖掘策略（“OSMAC-基因组-转录组”策略）,用于全面挖掘Saccharothrix sp.D09中的次级代谢产物。首先,通过OSMAC和比较转录组分析,分析了所有基因簇的转录水平,发现仅有3个基因簇的转录水平较高,其余大部分基因簇都处于转录沉默状态。生物信息学分析表明有两个高转录的基因簇较新颖,可能负责合成新的产物。因此,对它们的产物进行了定向分离,获得了两类共计18个新化合物:脂肽类铁载体saccharochelins A-H（1-8）和角环素（angucyclines）类化合物 saccharothrixins D-M（9-18）。Saccharochelins 对 4 种人类肿瘤细胞系（A549,MCF-7,HCT-116和HepG2）均表现出良好的细胞毒性,IC50范围为2.3～17μM。Saccharochelins是首次从Saccharothrix属中报道的铁载体,其N端带有长的脂肪酸链,长链脂肪酸被认为能够锚定于细胞膜上而减少铁载体在海洋环境中的扩散损失。Saccharochelins的这一结构特征不仅体现了 Saccharothrix sp.D09对海洋环境的适应性,也显著影响着saccharochelins的细胞毒性;Saccharothrixins是在新颖氧化还原酶作用下产生的一类高度氧化的芳香聚酮化合物,具有中等抗细菌活性,对幽门螺杆菌Helicobacter pylori G27,H.pylori 159 和金黄色葡萄球菌 Staphylococcus ATCC25923 的 MIC 为 16 μg/mL。此外,saccharothrixins F（3）还通过抑制巨噬细胞RAW 264.7中由LPS诱导的NO生成而表现出抗炎活性,IC50为28 μM。之后,利用Red/ET重组工程技术对这两个基因簇进行了原位敲除和直接克隆与异源表达,验证了它们的生物合成途径。此外,通过生物信息学分析、基因敲除和比较代谢组学确定了另一个高转录的PKS（polyketide synthase）基因簇（BGC10）的产物为已知化合物micromonolactam。对于D09中转录水平低的基因簇,运用了启动子工程、异源表达等多种手段提高其转录水平。通过用强启动子SP44和ermEp21原位替换原始启动子,成功激活一个沉默的NRPS（nonribosomal peptide synthetase）基因簇,获得两个新的多肽化合物（30和31）。该类化合物含有非天然氨基酸2,4-二氨基丁酸（2,4-diaminobuyric acid,Dab）,推测其生物合成过程涉及模块的跳跃和重复使用等“非共线性”现象。此部分利用“OSMAC-基因组-转录组”策略从Saccharothrix sp.D09中识别了 4个基因簇的产物,累积鉴定了 3类共计20个新化合物,一方面说明了D09是优良的次级代谢产物产生菌,同时也验证了该挖掘策略的可行性。（3）芽孢杆菌中bacillothiazols的分离鉴定和生物合成研究除了放线菌,芽孢杆菌也是天然产物的重要生产者,其基因组上也蕴藏着丰富的沉默基因簇有待挖掘。通过对植物根际促生菌Bacillus velezensis FZB42中一个沉默基因簇（nrs）异源表达产物的分离鉴定,共得到了 16个新化合物（bacillothiazols A-P,32-47）,它们具有罕见的三联噻唑骨架,且C末端通过酰胺键额外连接了多种不同氨基酸标签。Bacillothiazols对蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatases,PTPs）具有很强的选择性抑制活性,其中,bacillothiazols C（34）和 E（36）对 PTP1B 的 IC50 值为 4.3 和 5.2 μM,但对TCPTP几乎没有抑制作用（IC50 value＞100 μM）。PTP1B是治疗Ⅱ型糖尿病的极具吸引力的靶点。然而PTPIB所属的PTPs家族其活性中心的序列高度相似,特别是TCPTP与PTP1B有74%的序列是相同的,这为专一性的PTP1B抑制剂的开发造成了巨大挑战。因此,bacillothiazols将有进一步开发成为治疗PTP1B相关疾病的先导药物的潜力。通过对bacillothiazols生物合成途径的解析,发现一个新颖、离散的氧化酶（NrsB）循环催化NRPS链延伸中三联噻唑啉的氧化过程,是NRPS中产生多联噻唑的一种新方式。利用定点突变进一步鉴定了 NrsB的催化关键位点,并提出了其催化迭代氧化的机制。这一结果填补了 NRPS中多联噻唑生成的研究空白,也推进了对噻唑环生物合成的认识。综上所述,本论文从海洋稀有放线菌糖丝菌Saccharothrix sp.D09和植物根际促生菌B.velezensis FZB42中获得了 4类共计34个新化合物,包括具有良好细胞毒性的铁载体saccharochelins A-H（1-8）、有抗细菌和抗炎活性的角环素saccharothrixins D-M（9-18）、新型线性多肽类化合物（30和31）和抑制PTP1B的新型多联噻唑类化合物bacillothiazols A-P（32-47）。并首次阐明了NRPS中多联噻唑啉迭代氧化的机制。以上结果不仅丰富了天然产物化合物库,也丰富了新颖的酶和其催化机制,显示了微生物,特别是特殊生境来源的稀有放线菌中仍存在大量新颖的次级代谢途径,可能合成新的活性产物;同时,药用菌种资源和新的挖掘策略的开发将促进新型活性产物的发现与利用。