研究背景骨肉瘤（osteosarcoma,OS）是最常见的原发性恶性骨肿瘤,由肉瘤性成骨细胞及其产生的骨样组织、新生骨构成。骨肉瘤的发病原因仍不明确,发病率男性略高于女性,可发生于各年龄阶段,但最多见于15～19岁,是青少年癌症相关死亡的第二大主要原因。骨肉瘤好发于股骨远端、胫骨近端、肱骨近端,即主要发生在下肢特别是膝关节周围。骨肉瘤多发生在骨骼生长发育的旺盛时期,易复发转移,是严重影响劳动生产力的重要肿瘤。早期诊断及早期治疗具有重要意义,目前骨肉瘤实验室检查中碱性磷酸酶和乳酸脱氢酶增高可提示骨肉瘤发生,但确诊需要影像学检查乃至肿瘤病理活检。目前针对骨肉瘤的标准疗法包括外科手术,化学疗法（如甲氨蝶呤、阿霉素和顺铂等）,和放射疗法在内的综合疗法。骨肉瘤细胞易发生侵袭转移是造成预后差的主要原因之一,因此,靶向骨肉瘤的转移可能是提高骨肉瘤临床治疗效果的良好策略。Sirtuins 是 NAD+（nicotinamide adenine dinucleotide）依赖的蛋白质去乙酰化酶,包括7个与酿酒酵母的沉默信息调节因子2（silent information regulator 2,Sir2）基因同源的家族成员（SIRT1-SIRT7）。七个sirtuins家族成员的亚细胞定位和功能各不相同,其中SIRT1、SIRT6和SIRT7主要位于细胞核,SIRT3、SIRT4和SIRT5位于线粒体,而SIRT2主要位于细胞质中。研究表明SIRT2在众多生物学过程和疾病中发挥着广泛的作用,是许多疾病的潜在治疗靶点。由于肿瘤类型的不同,SIRT2在肿瘤中可起到促进或者抑制作用。SIRT2在乳腺癌、肝癌、肺癌、白血病等恶性肿瘤中的研究较多,但SIRT2在骨肉瘤发生发展及转移中的作用尚不明确。上皮-间充质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT）是肿瘤向侵袭和转移特性发展的第一步,在EMT过程中,上皮细胞的细胞极性消失、其形态和结构发生改变失去上皮细胞特征,同时细胞之间的黏附性丧失,成为具有迁移和侵袭性的间充质细胞,并突破基底膜向周围组织浸润,使早期肿瘤转化为侵袭性肿瘤。EMT是使上皮来源的恶性肿瘤转移的关键步骤,然而,其在间充质来源的肿瘤如骨肉瘤中的作用仍不清楚。本研究拟揭示SIRT2在骨肉瘤中的表达及功能,并通过体内、体外实验深入解析SIRT2对骨肉瘤细胞侵袭转移的调控作用及分子机制,将有助于开发针对骨肉瘤侵袭和转移的新靶点。实验方法与结果1.利用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）和Western blot检测人成骨细胞hFOB1.19和几种常见骨肉瘤细胞MG63、HOS、U2OS及Saos-2中SIRT2的mRNA及蛋白表达水平,发现SIRT2 mRNA及蛋白在骨肉瘤细胞MG63和Saos-2中高表达。采用免疫组织化学染色检测38例骨肉瘤患者的肿瘤组织及9例正常骨/骨髓组织中SIRT2的表达,发现SIRT2在骨肉瘤组织中的表达明显升高。2.利用SIRT2的小干扰RNA（siRNA）分别转染MG63及Saos-2细胞,通过细胞计数试剂盒-8（Cell counting kit-8,CCK-8）实验探究SIRT2对骨肉瘤细胞增殖能力的影响,利用Transwell迁移及侵袭实验检测骨肉瘤细胞迁移及侵袭能力变化,利用划痕实验分析骨肉瘤细胞迁移能力的变化。结果显示,利用siRNA敲低SIRT2显著抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移及侵袭。在低表达SIRT2的骨肉瘤细胞U2OS细胞中转染pENTER-SIRT2-C-Flag-His表达质粒,上调U2OS中SIRT2的表达。CCK-8实验、Transwell迁移及侵袭实验和划痕实验进行检测。结果显示,过表达SIRT2促进了骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力。3.在MG63和Saos-2细胞中敲低SIRT2的表达,在U2OS细胞过表达SIRT2,利用Western blot检测与癌症侵袭转移相关的EMT相关蛋白的表达情况。结果显示,敲低SIRT2后,细胞间质标志物神经性钙黏蛋白（N-cadherin）表达降低,波形蛋白（Vimentin）表达降低;基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinases,MMP2）和MMP9表达降低。而过表达SIRT2后,EMT上皮标志物上皮性钙黏蛋白（E-cadherin）表达降低,间质标志物 N-cadherin,Vimentin 及 MMP2,MMP9的表达升高。免疫荧光检测N-cadherin及Vimentin,发现敲低SIRT2后,N-cadherin及Vimentin的荧光强度减弱,过表达SIRT2后,N-cadherin及Vimentin的荧光强度增强。4.利用SIRT2的shRNA慢病毒（lentivirus）感染MG63细胞,感染48h后通过荧光显微镜观察慢病毒感染效率,同时利用Western blot检测,结果显示SIRT2 shRNA下调了 MG63细胞中SIRT2的表达,证实稳定敲低SIRT2的骨肉瘤细胞系的建立。利用裸鼠皮下成瘤实验检测稳定敲低SIRT2的细胞移植裸鼠皮下后的成瘤情况。于裸鼠左侧前肢腋下皮下分别注射稳定敲低SIRT2的MG63细胞及对照细胞,观察比较两组裸鼠的肿瘤大小,定期测量肿瘤体积绘制瘤体的生长曲线,发现稳定敲低SIRT2显著抑制了肿瘤的生长。注射细胞12天后处死小鼠,剥离瘤体后称重,结果显示,稳定敲低SIRT2组肿瘤的体积和重量显著低于对照组,说明敲低SIRT2抑制了裸鼠体内骨肉瘤细胞的增殖。对瘤体组织进行HE染色,发现稳定敲低SIRT2组具有完整的肿瘤包膜,而对照组包膜被破坏,说明敲低SIRT2抑制了肿瘤的侵袭性。为探讨SIRT2对体内骨肉瘤细胞转移能力的影响,分别向裸鼠尾静脉注射稳定敲低SIRT2的骨肉瘤细胞和对照细胞,建立体内肿瘤转移模型。结果发现,对照组中裸鼠的荧光强度明显强于SIRT2敲低组,并且荧光主要分布在胸部和腹部,说明敲低SIRT2抑制了肿瘤的转移。此外,SIRT2敲低组肺脏和肝脏的荧光强度减弱,肺脏和肝脏的转移结节明显减少。HE染色进一步证实SIRT2敲低组,肺脏和肝脏转移性结节明显减少。5.为探究SIRT2促进骨肉瘤细胞侵袭转移的机制,我们利用BioGRID数据库及HitPredict数据库查询与SIRT2相互作用的分子,发现SIRT2和转录因子Snail可能相互结合。我们在MG63细胞中过表达SIRT2（penter-SIRT2-C-Flag-His质粒）和Snail（pcDNA3.1-Snail-c-HA质粒）,分别用Flag和HA抗体进行沉淀,检测外源性融合蛋白Flag-SIRT2与HA-Snail的结合情况,免疫共沉淀（Co-IP）结果证明SIRT2与Snail可以相互结合。利用Western blot检测SIRT2高表达的骨肉瘤细胞中Snail的表达情况,发现在MG63和Saos-2细胞中Snail高表达,说明SIRT2的表达与Snail的表达正相关。在MG63和Saos-2细胞中敲低SIRT2,发现Snail表达减少;而在U2OS细胞中过表达SIRT2,发现Snail表达升高,进一步提示SIRT2正调控Snail的表达。我们对前面成瘤小鼠的瘤体组织进行SIRT2及Snail的免疫组化染色,发现敲低SIRT2后,不仅SIRT2的染色减弱,Snail的染色也相应减弱,印证了体内SIRT2对Snail的正调控作用。接下来,我们利用免疫荧光实验进行检测,结果显示在MG63及Saos-2细胞中敲低SIRT2的表达后,Snail的荧光强度减弱,而在U2OS细胞中过表达SIRT2后,Snail的荧光强度升高,进一步说明SIRT2对Snail的正调控作用。在过表达SIRT2的U2OS细胞进行免疫荧光染色,发现SIRT2与主要位于细胞核的Snail共定位。6.我们进一步探究SIRT2调控Snail的分子机制。利用SIRT2的小分子活性抑制剂AGK2处理MG63细胞,发现Snail表达呈剂量依赖性减少,说明SIRT2通过其去乙酰化酶活性上调Snail。蛋白合成抑制剂环己酰亚胺（CHX）处理MG63细胞来抑制蛋白合成,再利用蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞,发现Snail的表达明显升高,说明Snail通过蛋白酶体途径降解。CHX处理细胞抑制蛋白合成,加AGK2处理细胞后Snail表达降低,进一步说明SIRT2通过其酶活性上调Snail;MG132与AGK2联合处理细胞,抑制了 Snail的降解,Snail表达升高,说明SIRT2通过其酶活性抑制Snail蛋白降解来上调Snail。研究结论与意义1.我们的研究发现组蛋白去乙酰化酶SIRT2在骨肉瘤细胞及组织中高表达,SIRT2主要位于骨肉瘤组织的胞浆。2.SIRT2促进骨肉瘤细胞的增殖、迁移及侵袭,并上调间质蛋白N-cadherin、Vimentin及基质金属蛋白酶MMP2、MMP9的表达。3.动物实验证实在骨肉瘤细胞稳定敲低SIRT2可抑制裸鼠体内肿瘤的生长及转移。4.机制研究发现SIRT2与转录因子Snail结合,二者的表达正相关,并且SIRT2通过抑制Snail的蛋白酶体降解而上调Snail。骨肉瘤具有高度侵袭性,而其侵袭转移的机制尚未完全阐明。大量文献已证实Snail可通过调控E-cadherin及间质蛋白的表达来诱导EMT,因此我们的研究提出SIRT2通过上调转录因子Snail,促进EMT进程利于骨肉瘤的侵袭转移。本研究阐明了 SIRT2促进骨肉瘤侵袭转移的作用及部分机制,为骨肉瘤的治疗提供了新的靶位和思路。