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肺纤维化是许多肺部疾病的普遍结局和主要特点,以成纤维细胞不断增殖致使细胞外基质不断沉积为主要特征。本研究着重从形态学上证实小鼠实验性肺纤维化病程中“上皮细胞-间充质细胞转变(EMT)”过程及骨桥蛋白(OPN)的表达变化,并利用药物干预推测二者的潜在关系。我们将78只健康雄性C57BL/6小鼠按其体重排序规律分为生理盐水对照组(NS)、博来霉素(BLM)模型组和曲尼司特用药组(BT)三个实验处理组。各组小鼠均在实验第一天采用口咽抽吸法经咽部注入气管相应的药液:模型组及用药组为50μl博来霉素溶液(浓度2mg/ml,剂量5mg/kg),对照组为50μl生理盐水;用药组从造模第一天起,至相应时间点为止,期间行曲尼司特药液(浓度10mg/ml,250mg/kg,每天一次)灌胃。各组小鼠分别在造模后第3d、7d、14d、21d及28d 5个时间点断颈处死后,取左肺制备石蜡切片,右肺液氮冻存后进行相关蛋白Western-blot检测。石蜡切片行苏木素-伊红染色(HE)及苦味酸天狼星红染色观察肺组织形态变化及胶原生成情况;行表面活性物质相关蛋白-C(SP-C)、上皮型钙粘蛋白(E-Cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、成纤维细胞特异蛋白1(FSP1)和骨桥蛋白(OPN)免疫组织化学染色,观察肺纤维化“上皮细胞-间充质细胞转变(EMT)”形态与OPN表达情况,并利用图像分析软件Image-Pro Plus 6.0(IPP6.0)测量切片累积吸光度(IOD),进行统计分析。利用液氮冻存肺组织对OPN生成量进行Western-blot半定量分析。HE及苦味酸天狼星红染色显示出小鼠肺组织正常的及纤维化病变进程中的组织结构形态变化;模型组小鼠肺组织胶原生成量随时间推移而增加,且与对照组相比二组的胶原生成量具有显著性差异(P＜0.05);用药组小鼠肺组织胶原生成量略低于同时期模型组肺组织胶原生成量。免疫组织化学结果显示OPN主要由气管壁及血管壁平滑肌层、肺间质巨噬细胞、肺泡上皮细胞生成;图像分析及Western-blot半定量分析均表明模型组OPN在病程初始的炎症期开始表达,并随病程进展持续升高,在病程中后期的纤维化阶段达到峰值;对照组OPN表达多见于气管壁及血管壁平滑肌层,表达量很少且各时间点恒定,与模型组相比具有显著性差异(P＜0.05);Western-blot结果显示用药组OPN表达量略低于同时期模型组的表达量。我们利用免疫组织化学染色方法进行EMT形态观察。SP-C及E-Cadherin被选为肺上皮细胞标志蛋白来观察肺纤维化进程中上皮细胞的变化,FSP1及Vimentin被选为肺间充质细胞标志蛋白来观察肺纤维化进程中间充质细胞的变化。免疫组织化学结果显示SP-C由Ⅱ型肺泡细胞生成,对照组SP-C阳性Ⅱ型肺泡细胞的细胞形态正常且数量恒定,模型组SP-C表达量随时间点推移有所增加,纤维化阶段的多数肺实变区域的阳性细胞较为集中、数量较多且胞体肥大变形;用药组与同时期模型组阳性细胞的数量及形态相比没有明显差别。免疫组织化学结果显示E-Cadherin主要由气管黏膜上皮及肺泡上皮细胞生成,对照组表达量多,而模型组在肺实变部位几乎未见表达,用药组与同时期模型组阳性细胞的数量相比没有明显差别。免疫组织化学结果显示FSP1主要由气管及血管周边区域及肺泡隔内的成纤维细胞生成;对照组阳性细胞数较少,模型组的肺实变部位阳性细胞的表达显著增多,用药组与同时期模型组的阳性表达没有显著差别。Vimentin主要由气管黏膜上皮及血管周、肺泡隔内的成纤维细胞生成,对照组数量较少,模型组及用药组的肺实变部位阳性细胞表达显著增多。总之,E-cadherin表达下调,SP-C与FSP1、vimentin在肺纤维化的实变区域共同表达,这些蛋白的表达变化提示肺上皮细胞表型缺失,且获得间充质细胞的特性,所以我们推测BLM诱导的肺纤维化进程中存在EMT。综上所述,根据EMT标志蛋白表达变化我们推论BLM诱导的肺纤维化中存在EMT,且与显著增加的OPN有潜在关系,进一步实验中可针对性地使用OPN相应抗体或OPN基因敲除等方法特异阻断OPN在机体中发挥作用,来进一步直接地探究EMT相关蛋白的表达变化,进而揭示OPN与EMT的具体关联。本实验研究为肺纤维化发病机制的进一步阐明提供形态学依据,为肺纤维化的有效治疗和药物研制开发提供新的靶点和思路。