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左乙拉西坦(Levetiracetam)为吡咯烷酮类新型抗癫痫药物,具有治疗指数高、安全性好、副作用轻微,且不与其他抗癫痫药物相互作用等优势,应用前景广阔,极具开发价值。以腈水合酶/R立体选择性酰胺酶为基础的生物法拆分制备左乙拉西坦——(S)-2-(2-氧代-1-吡咯烷)丁酰胺,反应条件温和、立体选择性专一,具有很好的应用前景,本文围绕该工艺路线,从生物催化剂的发现、表征、制备与应用这四个方面展开研究。首先对实验室保藏的一株腈水合酶产生菌Rhodococcus boritolerans FW815催化2-(2-氧代-1-吡咯烷)丁腈的反应条件进行了研究,发现该菌株腈水合酶适宜催化的pH范围较广(pH7-9),最适温度为40℃,测得其表观活化能Ea为 40.38 kJ/mol。R.boritoleransFW815具有良好的热稳定性和使用批次稳定性,在30℃下半衰期为10.8h,菌体使用七批次后,酶活仍保留原来的60%。添加金属离子和有机溶剂对该酶促反应均没有促进作用,底物抑制和产物抑制现象并不明显,但该酶催化底物的转化率随着底物浓度的升高逐渐降低,酶促反应动力学研究测得Km为 24.92mM,Vmax为 3.13mmolmin-1g-1。通过一种基于酰胺酶酰基转移反应的筛选模型成功地从土壤中筛选到一株对2-(2-氧代-1-吡咯烷)丁酰胺具有R立体选择性的酰胺酶产生菌ZJB-09227,根据形态学、生理生化试验、Biolog自动鉴定系统、16SrDNA序列及系统发育分析结果,鉴定该菌株为Mycobacterium diernhoferi,是该种内首次报道的产R型酰胺酶菌株。该菌株的胞内酰胺酶具有良好的热稳定性,在30、40、45℃条件下,半衰期分别为161.97、77.25和7.94 h,高浓度尿素对其活性有一定的抑制作用。通过单因素实验和正交实验,对M.diernhoferi ZJB-09227产酰胺酶培养基组成进行了优化。确定较佳的培养基组成为(g/L):葡萄糖11,酵母膏 15,己内酰胺 1.5,KH2PO41,K2HPO41,NaCll。适宜的培养条件为:初始pH 6.5,培养温度30℃,接种量4%(v/v),装液量80mL/500mL。在上述条件下发酵45h后酶活达到最高315.5U/L,是出发前的1.78倍。论文最后对ZJB-09227酰胺酶催化的反应条件进行了研究,发现该酰胺酶催化的pH范围较广(pH7-10),最适缓冲体系为磷酸盐缓冲液(pH=8),在50℃时酶活达到最高,初速度达5μ molmin-1g-1,温度对其选择性的影响相对较小,测得其表观活化能Ea为74.67kJ/mol。添加金属离子和有机溶剂对该酰胺酶酶活都没有促进作用,反应体系最佳菌体添加量为0.7g/10mL,该酶促反应几乎不存在底物抑制现象,但存在产物抑制,且造成产物抑制的主要原因是铵离子,对酶促反应动力学进行了初步研究测得Km的值为7.899mM,Vmax的值为1.58 μmolmin-1g-1。