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第一部分亚低温对匹罗卡品癫痫持续状态幼鼠海马损伤的保护作用研究目的:探讨亚低温在癫痫持续状态时的神经保护作用,比较不同亚低温干预时间(2小时、4小时、8小时)的保护作用。方法:采用21日龄的wistar大鼠经腹腔注射匹罗卡品制作惊厥持续状态的模型。随机分成NS对照、SE30分钟单纯安定治疗、SE30分钟亚低温联合安定治疗2小时、SE30分钟亚低温联合安定治疗4小时、SE30分钟亚低温联合安定治疗8小时、SE60分钟单用安定治疗、SE60分钟亚低温联合安定治疗8小时组,共7组。干预后72小时取材,经HE染色和Nissl染色观察大鼠海马组织形态学变化和损伤情况;MAP2免疫组织化学染色评价大鼠海马神经元细胞骨架蛋白的影响;通过免疫组织化学方法检测caspase-3,并进行caspase-3和NeuN免疫荧光双标记、TUNEL原位凋亡检测大鼠海马神经元的凋亡情况。结果:SE30分钟、SE60分钟后大鼠海马神经元出现不同程度的病理损伤,HE染色和Nissl染色发现海马CA1和CA3区均出现明显的神经元间隙增宽、胞浆溶解、核固缩、核溶解,Nissl颗粒减少等现象,坏死细胞计数百分比和NS组相比明显增高,差异存在统计学意义(P＜0.05)。亚低温联合安定治疗2小时即显著减少海马CA3区神经元细胞的坏死,与安定单一治疗组相比,差异具有统计学意义(P＜0.05)。亚低温联合治疗8小时的海马神经元形态和坏死细胞计算百分比NS对照组最为接近。MAP2免疫组化检测发现,SE30分钟、SE60分钟后大鼠海马神经元细胞骨架结构损伤明显,和NS组相比差异具有显著的统计学意义(P＜0.05)。和单一应用安定治疗组相比,亚低温联合治疗2小时即可显著升高海马CA3区神经元MAP2的表达水平,差异具有统计学意义(P＜0.05)。CA1区MAP2表达水平显著升高发生在亚低温干预8小时后,差异具有统计学意义(P＜0.05)。而SE60分钟后给予亚低温联合干预2小时,MAP2表达水平的升高无统计学意义。Caspase-3免疫组织化学以及TUNEL原位检测发现,SE30分钟、SE60分钟后大鼠海马神经元细胞发生明显的凋亡,和NS组相比差异具有显著的统计学意义(P＜0.05)。亚低温联合治疗8小时后,CA1和CA3区caspase-3蛋白表达明显下降,差异具有统计学意义(P＜0.05)。而TUNEL检测发现,亚低温联合干预2小时后CA1和CA3区凋亡细胞明显减少,和未干预组相比,差异具有统计学意义(P＜0.05)。caspase3和NeuN免疫荧光双标结果发现,亚低温8小时后,双标神经元数量明显减少。结论:1.癫痫持续状态导致大鼠海马神经元细胞的坏死、凋亡以及神经元细胞骨架塌陷。2.亚低温干预能减少海马神经元的坏死、凋亡和细胞骨架蛋白的丢失,具有神经损伤保护作用。3.和亚低温持续治疗2小时、4小时相比,持续治疗8小时具有更好的神经保护作用。第二部分亚低温对匹罗卡品癫痫持续状态幼鼠海马损伤的神经保护机制的研究目的:通过研究离子型和代谢型谷氨酸受体核酸以及蛋白表达变化,探讨亚低温以及不同亚低温干预时间对癫痫持续状态幼鼠海马神经元损伤的保护机制。方法:采用21日龄的wistar大鼠共60只,经腹腔注射匹罗卡品制作癫痫持续状态的模型。随机分成5组,具体分组同第一部分,每组12只。干预后72小时,每组随机挑选6只幼鼠,灌流取脑海马切片,采用免疫组化方法检测各组幼鼠海马各区GLUR-1和GLUR-2蛋白表达水平变化;每组其余6只幼鼠活体分离出双侧海马组织,分别采用实时荧光定量PCR法和Western-blotting免疫印迹技术检测各组幼鼠海马GLUR-1、GLUR-2和mGLUR1-αmRNA和蛋白表达水平。结果:免疫组化发现,SE30分钟后,海马CA1和CA3区的GLUR-1蛋白表达明显升高而GLUR-2蛋白表达明显降低,与NS组相比,差异存在统计学意义(P＜0.05)。亚低温干预后可以降低海马CA1和CA3区GLUR-1蛋白表达而增加GLUR-2蛋白表达,亚低温干预8小时后,两者的蛋白表达与和未给予亚低温干预组相比差异具有统计学意义(P＜0.05)。Western-blotting发现海马GLUR-1和GLUR-2蛋白表达变化与免疫组化结果相似,亚低温干预4和8小时后,两者的蛋白表达与和未给予亚低温干预组相比差异具有统计学意义(P＜0.05)。SE30分钟后,海马mGLUR1-α蛋白表达有升高,亚低温联合安定治疗后可以降低海马mGLUR1-α蛋白表达,亚低温干预8小时后,mGLUR1-α蛋白表达与和未给予亚低温干预组相比差异具有统计学意义(P＜0.05)。RT-PCR结果发现,SE30分钟后,海马GLUR-1和mGLUR1-αmRNA表达增加,而GLUR-2mRNA表达下降,亚低温联合安定治疗后GLUR-1和mGLUR1-αmRNA表达下降,GLUR-2mRNA表达有升高,亚低温干预8小时后GLUR-1和mGLUR1-αmRNA表达和未给予亚低温干预组相比有统计学差异(P＜0.05),但GLUR-2mRNA表达和未给予亚低温干预组相比无统计学差异。结论:GLUR-1、GLUR-2和mGLUR1-α共同参与癫痫持续状态后神经元损伤的形成,亚低温通过下调GLUR-1mRNA和蛋白表达,上调GLUR-2蛋白表达,下调mGLUR1-αmRNA和蛋白表达,减少神经元损伤。