论文部分内容阅读
广州管圆线虫病 (Angiostrongyliasis) 是由于感染广州管圆线虫(Angiostrongylus cantonensis，Ac)而引起的。广州管圆线虫病并作为一种重要的人兽共患寄生虫疾病，主要发生在中国、东南亚和南太平洋地区，该病可引起严重的中枢神经系统感染症状，严重者可导致瘫痪或死亡。本课题组前期研究发现Ac-Galectin-1在广州管圆线虫生长发育阶段发挥着重要的作用，是构成虫体体壁的重要成分，促进幼虫发育成成虫；Ac-Galectin-1可以通过抑制IFN-γ，IL-5分泌发挥免疫抑制作用，Ac-Galectin-1还促进Treg细胞聚集，发挥免疫下调作用。 半乳糖凝集素在细胞内外均可以发挥其生物学功能，当分泌到胞外时，主要发挥凝集素的功能，包括细胞-细胞、细胞-细胞外基质的相互作用，细胞活化，细胞自噬，细胞凋亡和细胞因子分泌等。由于半乳糖凝集素可以和细胞膜上的多种糖蛋白受体形成不同类型的晶格结构，从而导致不同的跨膜信号通路被激活，因此，半乳糖凝集素可以广泛参与调节多方面的生物学过程。但广州管圆线虫Galectin-1的功能研究未见报道。根据广州管圆线虫的生活史，广州管圆线虫幼虫进入人体后会有一个阶段存活在血液里，最终到达脑脊液中。具有免疫调控作用的广州管圆线虫的分泌组分在免疫应答中的作用值得深入研究，巨噬细胞作为抗原提呈细胞和非特异性免疫细胞，它们在感染免疫中的快速动员及Ac-Galectin-1对其的作用直接影响免疫应答的发生发展。由于外周血来源的单核巨噬细胞较难获取、获取细胞数量较少以及血液来源存在个体差异，因此我们采用THP-1来进行研究。本实验以经过佛波酯刺激的THP-l细胞分化为贴壁的巨噬细胞为研究对象，旨在通过观察Ac-Galectin-1对THP-1的作用及具体机制，为广州管圆线虫侵入后其分泌蛋白的免疫调控作用的研究提供一定的实验基础。 目的： 1.镍柱亲和层析方法纯化得到广州管圆线虫Galectin-1重组蛋白； 2.Ac-Galectin-1作用于THP-1来源的巨噬细胞，观察凋亡现象及凋亡相关蛋白的表达； 3.筛选与验证与Ac-Galectin-1相互结合的THP-1细胞膜表面受体蛋白； 4.探究Ac-Galectin-1诱导巨噬细胞凋亡的相关信号通路蛋白，揭示广州管圆线虫Galectin-1重组蛋白诱导该细胞凋亡的相关机制。 方法： 1. Ac-Galectin-1蛋白纯化及Ac-Galectin-1诱导巨噬细胞凋亡的检测 重组广州管圆线虫Galectin-1蛋白经IPTG大量诱导表达后，采用镍离子亲和层析法纯化目的蛋白，并作用于经PMA诱导THP-1而成的巨噬细胞。采用CCK-8，流式细胞术方法检测Ac-Galectin-1对巨噬细胞的凋亡作用，并用Western Blot检测凋亡相关蛋白的表达情况。 2.IP、质谱及Co-IP等实验验证Ac-Galectin-1与巨噬细胞上受体蛋白Annexin A2的相互作用 采用免疫荧光实验观察Ac-Galetin-1与巨噬细胞膜蛋白Annexin A2的共定位现象。采用IP技术及质谱鉴定技术，可以获取与Ac-Galectin-1结合的巨噬细胞膜蛋白，并用Co-IP实验进行反向验证。 3. Ac-Galectin-1诱导巨噬细胞凋亡的信号通路相关蛋白分析 巨噬细胞经Ac-Galectin-1蛋白作用可引起巨噬细胞凋亡并出现相应蛋白活化，通过磷酸化抗体芯片检测凋亡信号通路蛋白的磷酸化水平，Western Blot进一步鉴定广州管圆线虫Galectin-1引起巨噬细胞凋亡的主要信号通路相关蛋白。 结果： 1. 纯化的Ac-Galectin-1作用于巨噬细胞，CCK-8和流式细胞检测发现，随着Ac-Galectin-1作用浓度越高，巨噬细胞的凋亡率越高。蛋白浓度在2μg/mL，细胞凋亡率约在30%左右；当Ac-Galectin-1蛋白作用浓度在10-100μg/mL，巨噬细胞凋亡率处于平台期，维持在60%-80%。Western Blot发现Ac-Galectin-1引起促凋亡相关蛋白caspase-3，-9，Bax表达量增加，凋亡抑制蛋白Bcl-2表达水平降低。 2. 纯化的His-Ac-Galectin-1特异性结合到镍离子金属beads上，和巨噬细胞裂解液共孵育，获得和Ac-Galectin-1相互结合的膜蛋白——Annexin A2；经过免疫荧光共定位实验和Co-IP实验验证Ac-Galectin-1与细胞膜蛋白Annexin A2发生相互作用，继而引起后续凋亡信号通路的变化。 3. 采用MAPK磷酸化抗体芯片，筛选参与细胞凋亡信号通路相关的磷酸化蛋白并用Western Blot验证。发现Ac-Galectin-1能够激活细胞膜受体Annexin A2磷酸化，进而引起JNK，Akt磷酸化水平升高，ERK磷酸化水平下降；当我们用JNK特异性磷酸化抑制剂SP600125作用于细胞后，再用Ac-Galectin-1刺激巨噬细胞，发现细胞凋亡程度减弱，JNK被抑制磷酸化的同时，凋亡蛋白caspase-3，-9，Bax表达量比单独使用Ac-Galectin-1作用时明显降低，Bcl-2表达量则恢复正常。同时还发现Ac-Galectin-1能够通过激活Akt磷酸化抑制巨噬细胞发生自噬，LC3-2表达水平降低。 结论： Ac-Galectin-1能够诱导巨噬细胞凋亡，通过和巨噬细胞膜表面Annexin A2相互作用并激活其磷酸化，促进JNK磷酸化，激活下游凋亡信号通路；同时初步发现Ac-Galectin-1可能具有抑制巨噬细胞发生自噬的作用。