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本研究以陆地棉抗旱品系中H177为实验材料,设置三个处理,CK、干旱胁迫(土壤相对含水量为7.0%)和干旱后复水,从全基因组水平对干旱响应的长链非编码RNA(lncRNA)进行鉴定和分析;对干旱响应的差异甲基化区域(DMRs)进行筛选及调控机制解析。结合差异表达的lncRNAs和DMRs相关基因,构建棉花干旱响应的DNA甲基化调控网络,主要结果有:
1、全基因组lncRNAs的鉴定与分析。基于严格的五步筛选法对干旱响应的lncRNAs进行过滤和筛选,获得了10,820高可信度的lncRNAs,包括9,989个lincRNAs(基因间lncRNAs)、153个inroniclncRNAs(内含子lncRNAs)、678个anti-senselncRNAs(反义链lncRNAs)。对上述三类lncRNAs进行特征和功能分析发现不同长度、结构和位置的lncRNAs在表达量和功能特征上存在差异。研究发现6,470个lncRNAs具有ORF的特征,具有蛋白编码潜能;miRNA前体预测有196个lncRNAs是miRNAs前体,表明lncRNAs参与了棉花抗旱机理的调控;表达量分析结果表明lncRNAs与其相邻的基因具有相一致的表达模式;GO和KEGG富集结果表明,lncRNA参与植物激素调节,通过激素含量的变化来响应干旱胁迫。
2、棉花干旱胁迫下的DNA甲基化变异分析。利用亚硫酸氢盐重测序方法对棉花干旱胁迫前后甲基化差异位点进行筛选,构建全基因组高分辨率DNA甲基化图谱。对差异甲基化区域(DMRs)检测分析发现31,223和30,997个DMRs(占全基因组的2.48%),表明干旱胁迫可以诱导基因组高甲基化模式。对mC发生的序列环境分析发现DNA甲基化的发生具有序列偏好性,与胞嘧啶C所在的序列环境和甲基化密度高低有关。对不同类型mC(mCG、mCHG和mCHH)的甲基化频率分析发现mCHH在干旱胁迫前后变化幅度最大,表明与干旱胁迫最密切相关。对DMRs相关基因进行GO、KEGG富集和甲基化特异性PCR分析发现46个激素相关基因的甲基化状态发生了改变,表明DNA甲基化参与了植物激素的调控,这是棉花干旱响应过程的一种重要表观遗传调控机制。
3、miRNAs在lncRNA参与DNA甲基化调控过程中的桥梁作用。对差异miRNA与DMR相关基因关联分析发现有5个miRNA参与靶基因的甲基化。同时将lncRNAs与miRNAs前体进行序列比较分析发现65个lncRNAs与miRNA前体存在高度同源性,表明miRNAs在lncRNAs参与DNA甲基化调控的过程中发挥着重要作用。靶基因甲基化特异性PCR和转基因抗旱性分析表明miRNAs参与了棉花干旱响应的甲基化调控。
本研究利用表观遗传学手段对陆地棉干旱响应的lncRNAs和DNA甲基化变异进行筛选和靶基因功能验证来揭示棉花的抗旱遗传机制,为棉花抗旱机制的研究和抗旱性育种提供了重要线索和理论依据。
1、全基因组lncRNAs的鉴定与分析。基于严格的五步筛选法对干旱响应的lncRNAs进行过滤和筛选,获得了10,820高可信度的lncRNAs,包括9,989个lincRNAs(基因间lncRNAs)、153个inroniclncRNAs(内含子lncRNAs)、678个anti-senselncRNAs(反义链lncRNAs)。对上述三类lncRNAs进行特征和功能分析发现不同长度、结构和位置的lncRNAs在表达量和功能特征上存在差异。研究发现6,470个lncRNAs具有ORF的特征,具有蛋白编码潜能;miRNA前体预测有196个lncRNAs是miRNAs前体,表明lncRNAs参与了棉花抗旱机理的调控;表达量分析结果表明lncRNAs与其相邻的基因具有相一致的表达模式;GO和KEGG富集结果表明,lncRNA参与植物激素调节,通过激素含量的变化来响应干旱胁迫。
2、棉花干旱胁迫下的DNA甲基化变异分析。利用亚硫酸氢盐重测序方法对棉花干旱胁迫前后甲基化差异位点进行筛选,构建全基因组高分辨率DNA甲基化图谱。对差异甲基化区域(DMRs)检测分析发现31,223和30,997个DMRs(占全基因组的2.48%),表明干旱胁迫可以诱导基因组高甲基化模式。对mC发生的序列环境分析发现DNA甲基化的发生具有序列偏好性,与胞嘧啶C所在的序列环境和甲基化密度高低有关。对不同类型mC(mCG、mCHG和mCHH)的甲基化频率分析发现mCHH在干旱胁迫前后变化幅度最大,表明与干旱胁迫最密切相关。对DMRs相关基因进行GO、KEGG富集和甲基化特异性PCR分析发现46个激素相关基因的甲基化状态发生了改变,表明DNA甲基化参与了植物激素的调控,这是棉花干旱响应过程的一种重要表观遗传调控机制。
3、miRNAs在lncRNA参与DNA甲基化调控过程中的桥梁作用。对差异miRNA与DMR相关基因关联分析发现有5个miRNA参与靶基因的甲基化。同时将lncRNAs与miRNAs前体进行序列比较分析发现65个lncRNAs与miRNA前体存在高度同源性,表明miRNAs在lncRNAs参与DNA甲基化调控的过程中发挥着重要作用。靶基因甲基化特异性PCR和转基因抗旱性分析表明miRNAs参与了棉花干旱响应的甲基化调控。
本研究利用表观遗传学手段对陆地棉干旱响应的lncRNAs和DNA甲基化变异进行筛选和靶基因功能验证来揭示棉花的抗旱遗传机制,为棉花抗旱机制的研究和抗旱性育种提供了重要线索和理论依据。