【摘 要】
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肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor alpha,TNFα）是一种主要由巨噬细胞产生的炎症细胞因子,具有诱导细胞凋亡和肿瘤死亡的能力,但TNFα诱导细胞凋亡的分子机制尚不明确。Bcl-2蛋白家族包括促凋亡成员如Bak,Bax和抗凋亡成员如Bcl-2,它们维持线粒体的完整性,也参与调控TNFα/CHX诱导的细胞凋亡。促分裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated pro
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肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor alpha,TNFα）是一种主要由巨噬细胞产生的炎症细胞因子,具有诱导细胞凋亡和肿瘤死亡的能力,但TNFα诱导细胞凋亡的分子机制尚不明确。Bcl-2蛋白家族包括促凋亡成员如Bak,Bax和抗凋亡成员如Bcl-2,它们维持线粒体的完整性,也参与调控TNFα/CHX诱导的细胞凋亡。促分裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase,MAPK）主要包括细胞外信号调节激酶1和2（Extracellular signal-regulated kinases 1 and 2,ERK-1/2）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun amino-terminal kinase,JNK）和p38丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase,MAPK）。PI3K/AKT也是一种重要的激酶,控制细胞的基本功能,如增殖,转录,翻译,生存和生长。本论文通过证明TNFα/CHX诱导的细胞凋亡主要依赖于Bak,而非Bax,首先阐明了Bak在TNFα/CHX诱导细胞凋亡中的作用,再通过不同抑制剂加入检测重要激酶活性,验证了p38,AKT,ERK及JNK在TNFα/CHX激发的信号传导通路途径中的相互关联,最后IP实验证明了Bak与AKT相互作用,TNFα/CHX处理后Bak-AKT复合物解离,Bak与AKT分别发挥其对细胞凋亡的作用。具体内容如下:（1）本实验首先将TNFα/CHX诱导的细胞分为细胞质及线粒体组分,检测Cyto C,Bax等线粒体内源性细胞凋亡途径相关促凋亡小分子的变化。结果表明,TNFα/CHX处理后,Cyto C从线粒体释放至胞浆中,Bax从细胞质中转移至线粒体,说明TNFα/CHX诱发线粒体内源性途径开启。为了进一步验证调控线粒体途径的重要蛋白Bcl-2家族对于TNFα/CHX诱导细胞凋亡的作用,本实验将Bcl-2质粒过表达至细胞中,结果发现Bcl-2过表达抑制TNFα/CHX诱导的细胞凋亡,验证了Bcl-2家族抗凋亡蛋白对于TNFα/CHX诱导的细胞凋亡的作用。（2）为了探索Bcl-2家族促凋亡蛋白Bax及Bak对于TNFα/CHX诱导细胞凋亡的作用,本实验利用si RNA技术分别敲低Bax及Bak蛋白水平,结果表明Bak对于细胞凋亡有阻断作用,而Bax没有影响。为了明确这一结论,本实验通过Crispr/cas9技术建立了Bak-/-细胞系,再次验证了Bak的阻断能力,不仅如此,Bak敲除抑制了Cyto C释放及Bax转移。（3）为了揭示MAPK及AKT在TNFα/CHX诱导信号通路中的作用及与Bak的关系,我们的实验结果发现Bak蛋白表达水平下降后会降低相关激酶的活化。本实验中通过不同激酶抑制剂的加入,明确TNFα/CHX处理后细胞信号通路中ERK、JNK、p38及AKT的相互关联,Western和免疫荧光结果显示p38和JNK的激活明显早于AKT和ERK,通过生物信息学网站HDOCK预测Bak与AKT相互作用,co-IP实验证明了在生理条件下Bak与AKT相互结合,复合物在与TNFα/CHX共处理后解离,Bak发挥其抗凋亡作用,AKT也被激活后发挥作用。综上所述,本论文揭示了Bak在TNFα/CHX诱导细胞凋亡中的重要作用,并且会引起相关激酶磷酸化水平的降低,Bak与AKT可以相互作用,加入TNFα/CHX解离后分别发挥作用,以上研究为深入挖掘TNFα/CHX诱导细胞凋亡分子机制的研究提供了有力的理论依据,并为其临床应用和药物开发提供了新的靶点。
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