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水貂是重要的皮毛用经济动物，被毛色泽是影响皮毛品质的关键因素，Agouti基因主要调控伪黑素的生成，在色泽绚丽的被毛生成中具有重要作用。作为毛色形成的重要野生型位点Agouti基因以及调控色素生成的其他基因在水貂毛色中的功能研究尚处起步阶段。本试验以黑貂、咖啡貂和白貂为试验材料对Agouti基因进行克隆、结构分析和进化研究，并对黑貂和咖啡貂皮肤组织转录组测序，对调控毛色合成的DCT和Tyrp1基因5UTR区克隆和启动子活性区域研究，为水貂皮毛色泽的遗传基础提供理论依据，并为丰富水貂皮毛色泽的育种实践提供指导。
PCR扩增测序获得包含全部编码区的长25478bp水貂Agouti基因序列(KP981640)，发现其中有53.9％的转座元件、34.5％的回文结构以及串联重复和SSR等，形成Agouti基因复杂的二级折叠结构。水貂Agouti基因内含子3存在601bp的SINE插入突变，缺失型为优势基因。黑貂该位点的基因型构成偏离哈德温伯格平衡状态，白貂和咖啡貂均处于平衡状态。黑貂的插入型基因频率低于白貂和咖啡貂(P＜0.05);对SINE缺失型998bp和插入型1605bp片段的正反两个方向的启动子活性检测，发现正向插入型1605bp片段具有显著的启动子活性(P＜0.05)，而反向片段和缺失片段均无活性(P＞0.05)。转录组数据发现601bpSINE在黑貂和咖啡貂皮肤组织中有长973bp的转录本表达，而Agouti基因无表达。
对38个物种112条Agouti基因序列和51种哺乳动物172条ASIP蛋白质氨基酸序列进行遗传多样性和进化分析，发现gouti基因在真骨鱼下纲和新颚超目中有较高的遗传多样性(θη=0.142和0.249)和进化速率(Dxy=0.230和0.294)，保守性最低(C=0.590和0.582);而在高等的简鼻亚目中具有最低的遗传分化程度(Dxy=0.012～0.017)和多态性(θη=0.010～0.017)，保守性最高(C=0.940～0.982)。Agouti基因在由鱼到人的物种进化分化过程中主要经历负选择;新颚超目的Agouti基因核苷酸序列中发现负选择压力，氨基酸序列中有2个负选择位点;鲸偶蹄目的核苷酸序列中发现正选择压力，氨基酸序列中有2个正选择位点;鼠总科经历正选择压力，简鼻亚目经历负选择压力。由鼠到人的51个物种的ASIP氨基酸序列，131个氨基酸中有18个保守位点，信号肽域进化速率(1.084)较高，空环域保守性(88.31％)较高。
对1月龄和6月龄黑貂和咖啡貂皮肤组织分别进行转录组测序数据分析。6月龄水貂Unigenes中8145条差异表达，其中咖啡貂上调的2006条、下调的6139条;差异表达基因在Notch信号通路显著富集(P=0.0058)，并且与背景基因比率较高(0.47);在角蛋白纤丝和中等纤丝两个Go功能节点显著富集(P＜2E-6)并且富集率高于0.6。1月龄水貂黑色素合成、色素沉积和黑素体膜3个与色素相关Go功能节点显著富集(P＜0.05)，毛囊发育功能节点富集性显著低于其他(P＜0.05);6月龄水貂与1月龄水貂同样在黑色素合成功能结点显著富集(P＜0.05)，但在毛囊发育和毛发细胞分化2个与毛发发育的功能结点显著富集(P＜0.05)，在黑素体成分功能结点富集性显著低于其他(P＜0.05)。黑貂和咖啡貂皮肤组织的黑色素合成相关基因MYO5A、Tyrp1、PMEL、MC1R、SLC45A2、TYR和OCA2表达差异。
PCR测序获得水貂DCT基因5UTR区8203bp序列(KY412850-KY412852)，发现36个SNP和1个长204bp的完整转座元件。比对分析推断204bp转座子来源于蜕皮动物门的索巴利吸虫，在犬形亚目分化之后侵入其基因组，成为食肉目特异can-SINE。水貂DCT基因上游-392～-361间32bp元件和近端域结构与其他顺式元件共同作用发挥启动子活性;位于-797～-688的CpG岛和-636～-608的GCbox结构沉默水貂DCT基因启动。位于-49～-39的M-box和-31～-24的TATA框调控水貂Tyrp1基因的基础转录，-277～-60区域存在增强子提高了Tyrp1基因的转录活性。Tyrp1基因在293T细胞的启动转录活性显著高于A375细胞(P＜0.05)。
综上:具有启动子活性的SINE插入与表达导致水貂Agouti基因转录沉默，Agouti基因的遗传多样性和分化与物种的进化程度和毛色特征的丰富度相关。为适应自然环境或人工育种需要，Agouti基因在不同物种分化过程经历了或正或负的选择压力，但总体上经历负选择。1月龄和6月龄的黑色和咖啡色水貂的差异表达基因均在黑色素合成功能结点显著富集。基因上游-392之后的调控元件共同作用启动了DCT的转录，而-797～-608的CpG岛和GCbox结构抑制了DCT转录。基因上游-60之后的区域足以启动Tyrp1的转录。
PCR扩增测序获得包含全部编码区的长25478bp水貂Agouti基因序列(KP981640)，发现其中有53.9％的转座元件、34.5％的回文结构以及串联重复和SSR等，形成Agouti基因复杂的二级折叠结构。水貂Agouti基因内含子3存在601bp的SINE插入突变，缺失型为优势基因。黑貂该位点的基因型构成偏离哈德温伯格平衡状态，白貂和咖啡貂均处于平衡状态。黑貂的插入型基因频率低于白貂和咖啡貂(P＜0.05);对SINE缺失型998bp和插入型1605bp片段的正反两个方向的启动子活性检测，发现正向插入型1605bp片段具有显著的启动子活性(P＜0.05)，而反向片段和缺失片段均无活性(P＞0.05)。转录组数据发现601bpSINE在黑貂和咖啡貂皮肤组织中有长973bp的转录本表达，而Agouti基因无表达。
对38个物种112条Agouti基因序列和51种哺乳动物172条ASIP蛋白质氨基酸序列进行遗传多样性和进化分析，发现gouti基因在真骨鱼下纲和新颚超目中有较高的遗传多样性(θη=0.142和0.249)和进化速率(Dxy=0.230和0.294)，保守性最低(C=0.590和0.582);而在高等的简鼻亚目中具有最低的遗传分化程度(Dxy=0.012～0.017)和多态性(θη=0.010～0.017)，保守性最高(C=0.940～0.982)。Agouti基因在由鱼到人的物种进化分化过程中主要经历负选择;新颚超目的Agouti基因核苷酸序列中发现负选择压力，氨基酸序列中有2个负选择位点;鲸偶蹄目的核苷酸序列中发现正选择压力，氨基酸序列中有2个正选择位点;鼠总科经历正选择压力，简鼻亚目经历负选择压力。由鼠到人的51个物种的ASIP氨基酸序列，131个氨基酸中有18个保守位点，信号肽域进化速率(1.084)较高，空环域保守性(88.31％)较高。
对1月龄和6月龄黑貂和咖啡貂皮肤组织分别进行转录组测序数据分析。6月龄水貂Unigenes中8145条差异表达，其中咖啡貂上调的2006条、下调的6139条;差异表达基因在Notch信号通路显著富集(P=0.0058)，并且与背景基因比率较高(0.47);在角蛋白纤丝和中等纤丝两个Go功能节点显著富集(P＜2E-6)并且富集率高于0.6。1月龄水貂黑色素合成、色素沉积和黑素体膜3个与色素相关Go功能节点显著富集(P＜0.05)，毛囊发育功能节点富集性显著低于其他(P＜0.05);6月龄水貂与1月龄水貂同样在黑色素合成功能结点显著富集(P＜0.05)，但在毛囊发育和毛发细胞分化2个与毛发发育的功能结点显著富集(P＜0.05)，在黑素体成分功能结点富集性显著低于其他(P＜0.05)。黑貂和咖啡貂皮肤组织的黑色素合成相关基因MYO5A、Tyrp1、PMEL、MC1R、SLC45A2、TYR和OCA2表达差异。
PCR测序获得水貂DCT基因5UTR区8203bp序列(KY412850-KY412852)，发现36个SNP和1个长204bp的完整转座元件。比对分析推断204bp转座子来源于蜕皮动物门的索巴利吸虫，在犬形亚目分化之后侵入其基因组，成为食肉目特异can-SINE。水貂DCT基因上游-392～-361间32bp元件和近端域结构与其他顺式元件共同作用发挥启动子活性;位于-797～-688的CpG岛和-636～-608的GCbox结构沉默水貂DCT基因启动。位于-49～-39的M-box和-31～-24的TATA框调控水貂Tyrp1基因的基础转录，-277～-60区域存在增强子提高了Tyrp1基因的转录活性。Tyrp1基因在293T细胞的启动转录活性显著高于A375细胞(P＜0.05)。
综上:具有启动子活性的SINE插入与表达导致水貂Agouti基因转录沉默，Agouti基因的遗传多样性和分化与物种的进化程度和毛色特征的丰富度相关。为适应自然环境或人工育种需要，Agouti基因在不同物种分化过程经历了或正或负的选择压力，但总体上经历负选择。1月龄和6月龄的黑色和咖啡色水貂的差异表达基因均在黑色素合成功能结点显著富集。基因上游-392之后的调控元件共同作用启动了DCT的转录，而-797～-608的CpG岛和GCbox结构抑制了DCT转录。基因上游-60之后的区域足以启动Tyrp1的转录。