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粗毛纤孔菌(Inonotus hispidus)是一种十分珍贵的药用真菌,其子实体及菌丝体中均含有三萜类化合物,三萜类化合物具有抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒、抗糖尿病等多方面药效,但国内外对粗毛纤孔菌的研究主要集中在多糖,针对三萜类化合物较少。因此本文主要研究粗毛纤孔菌中重要活性物质之一三萜类化合物,经试验确定选用粗毛纤孔菌菌丝体进行液态深层发酵,优化其发酵条件后再进一步筛选多种诱导剂,最大程度提高总三萜量,随后进行分离纯化及降血脂功能的研究,为进一步工业化深加工三萜类物质并加以运用而奠定基础。
本实验对比研究了粗毛纤孔菌子实体与菌丝体中的主要活性物质,结果发现菌丝体中三萜类化合物、多糖及蛋白质含量均显著(P<0.05)高于子实体。以菌丝体量及三萜类化合物含量为指标,研究了液态深层发酵法制备粗毛纤孔菌三萜类化合物(Triterpenoids in the Inonotus hispidus,IH-TRI)的发酵工艺,单因素及正交实验结果显示,在接种量为8%,转速125r/min,温度26℃,发酵时间10天,培养基配比25%,pH值为6的条件下进行发酵,样品的菌丝体量为5.11g/L(发酵液),三萜含量为32.89mg/g,三萜总产量可达到168.07mg/L。
本实验研究了茉莉酸甲酯(MeJA)、水杨酸(SA)、油酸、3种金属离子及水曲柳煎汁等7种诱导剂对发酵过程中三萜类化合物合成量的影响,确定诱导剂最佳浓度及诱导时间,实验结果表明,7种诱导剂均能显著(P<0.05)促进粗毛纤孔菌菌丝体生长及三萜类化合物合成,其中油酸的诱导效果最佳,其次为SA、MeJA、水曲柳煎汁,诱导效果较低的为3种金属离子。在第0天加入3%油酸可得到菌丝体的量为7.146±0.131g/L,菌丝体中三萜含量为56.377±3.178mg/g,三萜总量为402.870mg/L,与不加入诱导剂的对照组相比三萜总量增加了143.74%。说明油酸可以作为促进粗毛纤孔菌三萜类化合物合成的有效诱导剂。
利用大孔吸附树脂及硅胶柱层析两种手段对IH-TRI粗提物进行分离纯化,通过比较10种不同树脂的静态吸附及解吸能力,试验结果表明D101型大孔树脂最适合IH-TRI的分离,且最佳洗脱条件为上样50mL0.5mg/mL浓度的粗毛纤孔菌三萜类化合物粗提液,以1.0mL/min过柱,先用蒸馏水洗脱2BV,再用60%乙醇,以1.0mL/min洗脱,经过一级纯化后IH-TRI纯度达到18.95%,与粗提物(4.19%)相比提高了4.52倍;运用薄层层析对硅胶柱层析洗脱剂进行筛选,最终得到氯仿∶甲醇∶水(15∶5∶1)系统最适合对IH-TRI进行分离,经过洗脱分别得到5个不同组分,平均纯度达到51.68%,与一级纯化物相比提高了2.73倍,与粗提物相比提高了12.33倍。本章研究提升了IH-TRI的纯度,为下一步分析三萜类化合物的结构提供基础。
本实验通过对胆酸盐结合能力及小鼠体内指标的测定,研究IH-TRI的降血脂功能。胆酸盐结合实验结果表明,IH-TRI粗捉物、一级纯化物及二级纯化物均对3种胆酸盐具有结合能力,其中二级纯化物与阳性药物辛伐他丁具有相似效果。小鼠毒理性实验结果表明,粗毛纤孔菌三萜类化合物能够降低小鼠血清及肝脏组织总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白(LDL-C),提高高密度脂蛋白(HDL-C)水平,且中剂量IH-TRI效果最为明显,各项指标均趋于空白对照组(健康小鼠),说明IH-TRI可以改善小鼠脂代谢紊乱,且通过测定总脂酶及脂肪酶初步判断IH-TRI降血脂的作用机理。IH-TRI还能显著提高肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)活性,抑制丙二醛(MDA)活力,表现出明显的抗氧化效果。
本实验对比研究了粗毛纤孔菌子实体与菌丝体中的主要活性物质,结果发现菌丝体中三萜类化合物、多糖及蛋白质含量均显著(P<0.05)高于子实体。以菌丝体量及三萜类化合物含量为指标,研究了液态深层发酵法制备粗毛纤孔菌三萜类化合物(Triterpenoids in the Inonotus hispidus,IH-TRI)的发酵工艺,单因素及正交实验结果显示,在接种量为8%,转速125r/min,温度26℃,发酵时间10天,培养基配比25%,pH值为6的条件下进行发酵,样品的菌丝体量为5.11g/L(发酵液),三萜含量为32.89mg/g,三萜总产量可达到168.07mg/L。
本实验研究了茉莉酸甲酯(MeJA)、水杨酸(SA)、油酸、3种金属离子及水曲柳煎汁等7种诱导剂对发酵过程中三萜类化合物合成量的影响,确定诱导剂最佳浓度及诱导时间,实验结果表明,7种诱导剂均能显著(P<0.05)促进粗毛纤孔菌菌丝体生长及三萜类化合物合成,其中油酸的诱导效果最佳,其次为SA、MeJA、水曲柳煎汁,诱导效果较低的为3种金属离子。在第0天加入3%油酸可得到菌丝体的量为7.146±0.131g/L,菌丝体中三萜含量为56.377±3.178mg/g,三萜总量为402.870mg/L,与不加入诱导剂的对照组相比三萜总量增加了143.74%。说明油酸可以作为促进粗毛纤孔菌三萜类化合物合成的有效诱导剂。
利用大孔吸附树脂及硅胶柱层析两种手段对IH-TRI粗提物进行分离纯化,通过比较10种不同树脂的静态吸附及解吸能力,试验结果表明D101型大孔树脂最适合IH-TRI的分离,且最佳洗脱条件为上样50mL0.5mg/mL浓度的粗毛纤孔菌三萜类化合物粗提液,以1.0mL/min过柱,先用蒸馏水洗脱2BV,再用60%乙醇,以1.0mL/min洗脱,经过一级纯化后IH-TRI纯度达到18.95%,与粗提物(4.19%)相比提高了4.52倍;运用薄层层析对硅胶柱层析洗脱剂进行筛选,最终得到氯仿∶甲醇∶水(15∶5∶1)系统最适合对IH-TRI进行分离,经过洗脱分别得到5个不同组分,平均纯度达到51.68%,与一级纯化物相比提高了2.73倍,与粗提物相比提高了12.33倍。本章研究提升了IH-TRI的纯度,为下一步分析三萜类化合物的结构提供基础。
本实验通过对胆酸盐结合能力及小鼠体内指标的测定,研究IH-TRI的降血脂功能。胆酸盐结合实验结果表明,IH-TRI粗捉物、一级纯化物及二级纯化物均对3种胆酸盐具有结合能力,其中二级纯化物与阳性药物辛伐他丁具有相似效果。小鼠毒理性实验结果表明,粗毛纤孔菌三萜类化合物能够降低小鼠血清及肝脏组织总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白(LDL-C),提高高密度脂蛋白(HDL-C)水平,且中剂量IH-TRI效果最为明显,各项指标均趋于空白对照组(健康小鼠),说明IH-TRI可以改善小鼠脂代谢紊乱,且通过测定总脂酶及脂肪酶初步判断IH-TRI降血脂的作用机理。IH-TRI还能显著提高肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)活性,抑制丙二醛(MDA)活力,表现出明显的抗氧化效果。