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背景:阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease,AD)是一种发生于老年期前后的慢性进行性神经退行性疾病,以进行性认知功能障碍为主要临床特征。AD脑内的主要病理改变是大脑皮质和海马内出现了β淀粉样蛋白(Amyloidβpeptide,Aβ)和Tau的变性蛋白聚集体,从而引起神经细胞的退行性死亡。AD的发病机制不清,尚缺乏有效防治措施。因此,探寻防治AD的新方法和新药物成为必然。传统中药因具有多靶向作用可能成为防治AD的理想策略。自噬在神经中枢中具有重要的神经保护作用。它可以有效加快清除胞内和胞外有毒性作用的和受损的蛋白聚集体,从而阻止神经元过度凋亡引起的神经元丢失以及AD的进程。近年来,越来越多的报道表明传统中药在维持脑内的自噬平衡中发挥重要作用。青蒿素类药物是传统中药青蒿中提取出来的倍半萜烯三氧杂环己烷内酯类药物。众多临床实验中,已证实该类药物不仅能有效治疗疟疾,且具有良好安全性。双氢青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)是青蒿素的主要活性代谢产物。大量研究证实,DHA在治疗多种疾病中发挥其诱导自噬,发挥细胞的自我清理能力。然而,DHA能否通过调节自噬来治疗AD尚无相关报道。方法:通过旷场实验,观察DHA对AD双转基因小鼠主动探索能力的影响;通过高架十字实验,观察对AD双转基因小鼠焦虑抑郁的影响;通过巴恩斯迷宫实验,观察DHA对AD模型小鼠的学习记忆和认知功能的影响;连续灌胃3个月DHA(20mg/kg/day)之后,通过检测小鼠血浆谷丙转氨酶(GPT/ALT)和谷草转氨酶(GOT/AST)以观察长期服用DHA对肝功能的影响;通过分别对小鼠皮质和海马区甲硫素和免疫组化染色,评估DHA对Aβ淀粉样蛋白的聚集和老年斑沉积的影响;通过分别对小鼠皮质和海马区的淀粉样蛋白Aβ42(Amyloidβpeptide 42,Aβ)和Aβ40进行ELISA检测,评估DHA对学习记忆相关脑区Aβ负荷的影响;通过Western blotting检测,评估DHA对Aβ产生相关酶:Aβ前体蛋白(Amyloid-βprecursor protein,APP)、β-分泌酶1(β-site APP cleaving enzyme 1,BACE1)、早老素1(Presenilin 1,PS1)和Aβ降解相关酶:胰岛素降解酶(Insulin degrading enzyme,IDE)、脑啡肽酶(Neprilysin,NEP)的影响。通过Western blotting实验,检测NeuN、NeuroD、MAP2、BDNF、synaptophysin、PSD95、GAP43蛋白指标,评估DHA对小鼠脑内神经元生长以及突触的影响;通过透射电镜,观察AD小鼠海马区突触密度定量、突触前膜囊泡数量、活性区长度、突触间隙宽度、突触界面曲率、突触后密集区厚度,评估DHA对小鼠海马区形成学习和记忆的突触可塑性的影响;通过透射电镜,观察AD小鼠海马区神经元凋亡的情况及DHA对神经元形态结构的影响;并结合Western blotting实验,检测凋亡相关指标(caspase-3、Bax、Bcl-2),评估DHA对AD小鼠脑内神经元凋亡的影响。通过Western blotting实验,检测LC3II/I和p62,评估DHA对AD小鼠脑内自噬流的影响;检测ATG5、ATG12、ATG16L1,评估DHA对自噬流早期自噬小体形成的影响;检测Beclin1、ATG14、p-ATG14(Ser29)、Rab7、RILP评估DHA对自噬流中期自噬小体和溶酶体融合的影响;检测Lamp1和Cathepsin B,评估DHA对自噬流晚期自噬溶酶体降解的影响;检测p-mTOR(Ser2448)、mTOR、ULK1、p-GSK3β(Ser9)、Total GSK3β,评估DHA对自噬起始的影响;以人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞)和小鼠神经母细胞瘤细胞(N2a细胞)稳定表达瑞士突变型APP基因的细胞株(APPswe)为AD细胞模型,并引入两种自噬抑制剂Bafilomycin A1(Bafi)和Chloroquine(CQ)和一种自噬激动剂Rapamycin(Rapa)。通过Western blotting实验,检测LC3II/I和p62,评估DHA是否能够恢复蛋白水平上被Bafi和CQ分别抑制的自噬流中期自噬小体和溶酶体融合过程和自噬流晚期自噬溶酶体降解过程。再通过透射电镜和共聚焦显微镜观察DHA是否能够恢复形态学水平上被Bafi和CQ分别抑制的这两个过程,并与阳性对照Rapa进行对比。结果:1.研究DHA对AD双转基因小鼠模型行为学的影响旷场实验结果发现,各自小鼠之间相比,进入中心区域次数、停留中心区域时间(秒)无显著差异,但WT对照组和DHA给药组小鼠运动长度(nm)显著长于AD对照组小鼠;高架十字实验结果发现,各自小鼠之间相比,进入开放臂次数和停留开放臂时间无显著差异;在巴恩斯迷宫实验结果中发现,DHA干预后的小鼠,无论是进入正确洞口的正确率,还是进入错误洞口的错误率均优于AD对照组。2.研究长期低剂量DHA对AD双转基因小鼠模型肝功能的影响血浆谷丙转氨酶(GPT/ALT)和谷草转氨酶(GOT/AST)检测发现,DHA治疗组与对照组相比,差异无显著性;3.研究DHA对AD双转基因小鼠模型脑内老年斑的影响小鼠皮质和海马区甲硫素和免疫组化染色发现,DHA能够减少Aβ淀粉样蛋白的聚集斑块,减少老年斑沉积;ELISA检测发现,DHA能够减少皮质区的Aβ42和Aβ40,以及海马的Aβ42负荷;Western blotting检测发现,DHA能够减少APP、BACE1的表达,但对PS1、IDE、NEP的表达无显著影响。4.研究DHA对AD双转基因小鼠模型脑内神经元的影响Western blotting实验发现,DHA上调了NeuN、NeuroD、MAP2、BDNF、synaptophysin的蛋白水平,但对PSD95、GAP43没有影响;透射电镜检测发现,DHA显著恢复AD小鼠海马区突触密度定量、突触前膜囊泡数量、活性区长度、突触间隙宽度。但与对照组相比,突触界面曲率、突触后密集区厚度没有显著性差异;在神经元形态上,通过透射电镜检测发现,DHA能减少AD小鼠海马区内神经元的凋亡;Western blotting实验发现,DHA能下调caspase-3和Bax的蛋白水平表达,同时上调Bcl-2的表达。5.研究DHA对AD小鼠模型的自噬功能失调的影响Western blotting实验发现,DHA干预组小鼠脑内LC3II/1比值上调,p62蛋白水平下调;在DHA干预后,反映自噬流早期(ATG5、ATG12、ATG16L1)、中期(Beclin1、ATG14、p-ATG14(Ser29)、Rab7、RILP)、晚期(Lamp1和Cathepsin B)的蛋白指标均有所改善;DHA干预后,p-mTOR(Ser2448)/mTOR比值、ULK1和p-GSK3β(Ser9)/Total GSK3β比值也上调;6.研究DHA通过对自噬的调节作用影响AD的潜在机制Western blotting实验发现,DHA能部分恢复被CQ上调的p62蛋白水平和Bafi上调的LC3II/I比值;同时,透射电镜检测发现,DHA能够部分缓解Bafi导致的晚期自噬小体堆积和CQ导致的溶酶体堆积;共聚焦显微镜下也观察到,DHA能够增加近核和原核阳性点数量,以及近核阳性点比例;DHA恢复被Bafi和CQ干预引起的细胞内阳性点分布异常。结论:DHA能够缓解AD小鼠模型的空间学习和记忆功能;长期低剂量DHA干预对小鼠肝功能影响较小;DHA降低Aβ沉积并抑制老年斑块聚集可能与调控AD相关降解酶无关。DHA促进AD小鼠脑内神经元的生长,具有神经营养作用;DHA部分恢复AD小鼠海马区突触可塑性;DHA能够抑制海马区Aβ诱导的神经元凋亡,从而减少AD小鼠脑内神经元丢失。DHA能够恢复AD小鼠脑内的自噬流不畅;DHA能够提高AD小鼠脑内的自噬早期、中期、晚期的基本水平;DHA触发自噬起始不是通过抑制mTOR实现的,并且其调节自噬流的特点也与Rapa有所不同。DHA能够部分纠正由Bafi导致的自噬小体与溶酶体融合障碍和自噬溶酶体降解障碍;DHA可能是通过其能够纠正AD小鼠脑内的自噬流不畅,提高自噬基本水平,来加快脑内Aβ的清除,预防Aβ导致的神经元毒性,减少凋亡引起的神经元过度丢失,恢复突触可塑性,最终纠正AD引起的学习和记忆认知功能障碍。