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miRNA是一类由内源基因编码的长度约为21-24 nt的非编码单链RNA分子,广泛存在于真核生物中。研究表明,miRNA在基因的转录后调控中起着非常重要的作用,参与调控胚胎发育、细胞分化、增殖、神经发生、代谢及细胞凋亡等几乎所有的生物过程,动物中约有50%以上编码蛋白基因的表达受到mi RNA的调控。家蚕是鳞翅目昆虫的重要代表,家蚕丝胶基因BmSer-1、BmSer-2是中部丝腺特异表达的基因,也是蚕丝蛋白的主要基因。研究显示蚕丝蛋白基因的表达受到miRNA的调控,但未见miRNA对丝胶基因表达调控研究的报道。为了研究家蚕miRNA对丝胶基因表达的调控作用,我们利用Solexa技术对家蚕P50和裸蛹(Nd)5龄幼虫中部丝腺组织RNA进行了高通量测序,鉴定获得若干保守miRNA和新mi RNA;通过生物信息学分析,预测到bmo-miR-275等可能参与BmSer-1、Bm Ser-2的转录后调控,并分别构建miRNA和靶基因3′UTR重组表达载体,在细胞水平进行了验证,取得如下主要研究结果。1.家蚕P50与裸蛹(Nd)突变品种5龄幼虫中部丝腺miRNAs的鉴定利用Solexa技术对家蚕P50与裸蛹(Nd)突变品种5龄3d幼虫中部丝腺进行了高通量测序,检测到272个保守miRNAs,并预测到333个新的miRNAs;其中86个miRNAs在P50与Nd中的表达存在显著差异。2.新预测家蚕miRNAs的qRT-PCR鉴定为了验证预测结果的可信性,对其中10个新预测mi RNA进行qRT-PCR鉴定,结果与测序结果相符;利用软件进行靶基因预测,保守miRNA和新预测miRNA分别预测到2522和1376个靶基因。3.家蚕丝胶基因BmSer-1、BmSer-2及相关mi RNA表达特性分析通过靶基因预测,发现bmo-miR-2771和bmo-miR-275分别是BmSer-1、BmSer-2的潜在靶基因,利用半定量PCR方法分析它们的表达特性,发现bmo-miR-2771只在中部丝腺中表达。4.Bmo-miR-2771对家蚕丝胶蛋白基因BmSer-1表达的调控作用构建表达bmo-miR-2771的重组质粒pcDNA3.0(ie1-egfp-pri-mir-2771-SV40)和表达BmSer-1 3′UTR的重组质粒pGL3(A3-luc-BmSer-1-3′UTR-SV40),共转染家蚕BmN细胞,结果显示bmo-miR-2771对BmSer-1基因表达具有负调控作用。5.Bmo-miR-275对家蚕丝胶蛋白基因BmSer-2表达的调控作用构建表达bmo-miR-275的重组质粒pcDNA3.0(ie1-egfp-pri-mir-275-SV40)和表达BmSer-2 3′UTR的重组质粒pGL3(A3-luc-BmSer-2-3′UTR-SV40),共转染家蚕BmN细胞,结果显示实验组荧光素酶活性降低,再转染人工合成bmo-mi R-275inhibitor后活性略有回升,证实bmo-miR-275对BmSer-2基因表达具有负调控作用。上述研究结果为阐明miRNA对蚕丝蛋白基因表达的调控机制和miRNA的功能提供了新的实验数据。