褐飞虱(Nilaparvata lugens Stal)是一种典型的植物韧皮部取食昆虫,是水稻(Oryza sativa L.)最严重的害虫之一。在感性水稻上,褐飞虱会造成植株的叶面积、光合速率、氮含量、叶绿素含量乃至干重的减少,同时,褐飞虱产卵量、卵和若虫存活率较高。田间褐飞虱的大量爆发通常导致“火虱烧”现象,即水稻叶和分蘖的枯萎变黄,造成水稻产量的急剧降低。褐飞虱还传播草状丛矮病和齿叶矮缩病等水稻病毒病。而在抗性水稻上,褐飞虱若虫的发育被扰乱,存活率明显比感性水稻上的低,成虫的产卵也被严重抑制。抗性水稻能够抑制褐飞虱种群的增长,降低植株受到的伤害并最终减少褐飞虱取食造成的产量损失。在水稻生产中,推广种植抗性品种是最有效和最环保的控制褐飞虱的方法。蛋白质组学已成为在蛋白质水平上分析生物体生理变化强有力的工具,但目前应用此技术对水稻褐飞虱取食应答的研究还很少。与高灵敏度质谱技术联用的相对定量蛋白质组学分析,由于其高通量、重复性和灵敏度特点,越来越多地应用于关键生物问题的研究。为了探讨防御相关蛋白在抗感性水稻株系应答褐飞虱过程中的作用,我们利用同位素标记相对和绝对定量(isobaric tag for relative and absolute quantitation, iTRAQ)蛋白质组分析,筛选水稻抗褐飞虱相关的蛋白质。我们提取了褐飞虱取食96小时后的水稻叶鞘蛋白质,结果显示多种蛋白质表达量在褐飞虱取食后发生了显著性变化。经iTRAQ鉴定,这些蛋白包括3个JA合成蛋白质(alpah-DOX, AOS和AOC),7个氧胁迫应答蛋白(CATA, APX2和5个POXs),3个β-葡聚糖酶(Gns1, Gns4和Gns5),3个蛋白激酶(CRK5,CRK6和atypical RLK),1个蛋白网格蛋白,1个甘氨酸分解系统H蛋白,5个光合作用相关蛋白和4个水通道蛋白。其中AOC, CATA,3个POX, Gns1,Gns5,3个蛋白激酶和网格蛋白更多地在感性水稻株系中被诱导。随后,我们用荧光定量PCR分析了8个重要蛋白质基因在抗、感性水稻中受褐飞虱取食后的表达情况。这8个基因的表达趋势与蛋白质相似。蛋白质组和基因表达的结果显示,抗性水稻株系(含抗性基因BPH15)和感性水稻株系中褐飞虱诱导的与伤害胁迫,氧胁迫和病原物胁迫相关的应答反应非常相似。而与胼胝质分解相关的蛋白质和基因在抗性水稻株系中表达水平不受褐飞虱影响,但甘氨酸分解系统H蛋白在抗性水稻株系受褐飞虱取食后表达水平上升了2倍,暗示抗性水稻中存在着高效特异的防御机制。我们认为抗感性水稻针对褐飞虱采取了不同的防御策略,抗性基因BPH15在其中起着决定性的作用。韧皮部是植物运输、分配光合作用合成的有机代谢产物的重要通道,它也是刺吸式昆虫取食植物的目标组织。除了糖和氨基酸这样的小分子外,高等陆生植物韧皮部汁液中还含有蛋白质。韧皮部汁液中的许多蛋白质参与了植物伤害和防御应答,并可能影响植物与昆虫间的相互作用。我们利用同位素标记的iTRAQ技术分析了感性水稻9311和抗性水稻B5叶鞘韧皮部汁液中的蛋白质。结果表明,韧皮部汁液蛋白质表达量受到了褐飞虱取食的显著影响。一共鉴定了238种韧皮部汁液蛋白质,涉及的功能包括糖代谢,活性氧／氧化还原反应,蛋白质修饰,信号传递等。其中,47种蛋白质在9311和B5之间表达量有着显著不同。在9311中54种蛋白质的含量在褐飞虱取食96小时后发生了显著变化；在B5中40种蛋白质发生了显著变化；11个蛋白质在9311和B5中含量变化的方向相反。我们的研究结果表明,在韧皮部汁液蛋白质水平上9311和B5对褐飞虱的应答是不同的。我们从中选取了5个重要的蛋白质,进行了原位杂交分析,试图从mRNA的水平研究这5个蛋白质在水稻韧皮部的表达模式。其中3个蛋白质在韧皮部检测到了阳性信号。为了进一步筛选韧皮部特异表达基因,我们采用激光显微切割技术收集了水稻韧皮部细胞和薄壁细胞,提取微量RNA,结合RNA体外线性扩增,获得了用于RT-PCR分析的纯净组织细胞RNA,用于进一步研究RGAP、Serpin、WDS和TCTP这4个基因在水稻韧皮部的表达模式,结果显示它们在韧皮部特异表达。我们对Serpin和Serpin的启动子进行了不同长度5’端缺失分析,以寻找控制维管束特异表达的区段和元件。